秦 冰 常淑瑩 劉芳翡 李 莉 胡亞瓊

(河南醫(yī)學高等?？茖W校，鄭州 451191)

睡眠被認為是維持和修復免疫功能必不可少的生理過程，睡眠干擾可影響機體健康從而造成各項生理功能紊亂[1]。影響睡眠的信號通路對于睡眠剝奪的機制尚未明確。miRNA在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控靶基因的表達，miR-155在免疫反應中是巨噬細胞、樹突狀細胞甚至上皮細胞中先天免疫應答的關鍵調(diào)節(jié)劑，在結腸炎T淋巴細胞和B淋巴細胞中發(fā)揮作用[2]。下游通路細胞因子信號傳送阻抑物(suppressor of cytokine signaling，SOCS1)/核因子κB(nuclear factor kappa beta，NF-κB)在免疫過程中可調(diào)節(jié)結腸炎的T細胞極化和擴增來調(diào)節(jié)黏膜免疫系統(tǒng)影響免疫功能，推測，miR-155/SOCS1/NF-κB通路可能影響睡眠[3]。基于此，本研究建立快速眼動(rapid eye movement，REM)睡眠剝奪大鼠模型，檢測miR-155/SOCS1/NF-κB對REM睡眠剝奪免疫方面的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 清潔級健康SD大鼠由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號： SCXK(京)2018-0013，動物使用許可證號：SYXK(京)2018-0037，動物質(zhì)量合格證號：20190301507，體質(zhì)量(200±20)g，所有大鼠均在溫度(25±0.5)℃、濕度(55±5)%、12 h光照/12 h黑暗實驗動物中心常規(guī)飼養(yǎng)。本動物實驗經(jīng)河南醫(yī)學高等?？茖W校動物倫理委員會批準，倫理審批號：IACUC-20190108007。

1.1.2主要試劑 改良平臺(直徑6 cm，高8 cm)；日光燈(40 W，深圳市長憶光電科技有限公司)；HE染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，貨號：G1120)；大鼠ELISA腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)、IL-1、IL-6試劑盒、一抗SOCS1(抗兔)、NF-κB(抗兔)、內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)(抗兔)、二抗羊抗兔(美國abcam公司，貨號分別為：ab208348、ab79277、ab100712、ab3691、ab220803、ab181602、ab6721)；BCA試劑盒、PVDF膜(碧云天生物科技有限公司，貨號分別為：P0012S、FFP32)；miRVana miRNA提取試劑盒(美國Ambion公司，貨號：AM1552)；2×Hi SYBR Green QPCR Mix(日本TaKaRa公司，貨號：ARR041A)；二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobenzidine，DAB)顯色試劑(索來寶科技有限公司，貨號：DA1010)。引物由上海生工生物公司合成。

1.1.3主要儀器 XK-SW002普通光學顯微鏡(美國Olympus公司)；7500實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction，qRT-PCR)儀(美國ABI公司)；5200蛋白凝膠成像儀(上海Tanon公司)。

1.2方法

1.2.1REM睡眠剝奪模型建立 30只大鼠分成3組，對照組、1 d REM睡眠剝奪組、7 d REM睡眠剝奪組，每組10只。按參考文獻[4]方法制備REM睡眠剝奪模型，利用改良多平臺睡眠法，1 d REM睡眠剝奪組日光燈照射持續(xù)1 d REM睡眠剝奪，7 d REM睡眠剝奪組日光燈照射持續(xù)7 d REM睡眠剝奪，對照組保持12 h光照/12 h黑暗。其余條件與正常飼養(yǎng)條件相同，且各組之間無影響。

1.2.2大鼠認知能力測試 采用迷宮法測試大鼠認知能力，模型建立前對所有動物進行Y型迷宮箱訓練，選擇活躍、對電擊敏感、逃避反應迅速大鼠進行實驗。對大鼠進行空間訓練和學習測試，迷宮中先適應3～5 min，然后無規(guī)則次序變換安全區(qū)。電擊后大鼠逃入安全區(qū)，然后以此為起點進行下一次測試，每次訓練20次，共3 d。測試大鼠足底通電后10 s內(nèi)一次性逃入安全區(qū)為正確反應，否則為錯誤反應。記錄大鼠每日出現(xiàn)錯誤反應次數(shù)。

1.2.3ELISA檢測血清中TNF-α、IL-1、IL-6水平 將上述靜脈血混合均勻，3 000 r/min離心10 min，收集血清后分裝待用。實驗時嚴格按照大鼠ELISA TNF-α、IL-1、IL-6試劑盒說明書步驟進行。

1.2.4HE檢測大鼠海馬組織、前額葉皮質(zhì)區(qū)形態(tài) 模型處理結束后，1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，肝素鈉抗凝管抽取靜脈血，迅速斷頭取腦，冰上分離海馬組織、前額葉皮質(zhì)區(qū)組織，部分置于-80℃冰箱保存待用，部分置于4%多聚甲醛中固定。將4%多聚甲醛中固定的組織取出，酒精中脫水，二甲苯透明，石蠟包埋、凝固后切片，切片厚度為5 μm。切片后HE染色，蘇木精染色、乙醇伊紅復染，酒精中脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學顯微鏡拍照。

1.2.5qRT-PCR檢測大鼠海馬組織、前額葉皮質(zhì)區(qū)組織中miR-155表達水平 采用qRT-PCR檢測大鼠海馬組織、前額葉皮質(zhì)區(qū)中miR-155表達水平。組織碾碎，RNA提取試劑盒提取組織中總RNA，反轉(zhuǎn)錄得cDNA。qRT-PCR儀對miR-155、內(nèi)參進行擴增。引物序列見表1。cDNA上樣量1 μl(50 ng/μl)，10 μmol/L 上下游引物各0.5 μl，miScript SYBR?Green Mix 10 μl，ddH2O 8.0 μl。反應條件：95℃、60 s；95℃、30 s，60℃、35 s，45個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法對組織中miR-155表達水平進行定量分析。

表1 miR-155及內(nèi)參引物Tab.1 miR-155 and internal reference primers

1.2.6Western blot檢測海馬組織、前額葉皮質(zhì)區(qū)組織中SOCS1、NF-κB蛋白表達 -80℃冰箱待用組織碾碎，TRizol法提取總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白總濃度，每孔上樣30 ng，PAGE膠分離蛋白質(zhì)，PVDF膜轉(zhuǎn)膜；5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；對應加入一抗SOCS1、NF-κB、GADPH(1∶5 000)，4℃孵育過夜；對應加入二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h。DAB顯色試劑顯色，蛋白凝膠成像儀拍照和定量分析。

2 結果

2.1睡眠剝奪對大鼠認知能力影響 與對照組相比，1 d、7 d REM睡眠剝奪組錯誤反應次數(shù)增加(P<0.05)；與1 d REM睡眠剝奪組相比，7 d REM睡眠剝奪組錯誤反應次數(shù)增加(P<0.05)。見表2。

表2 3組大鼠認知能力比較Tab.2 Comparison of cognitive ability of three groups of

2.2睡眠剝奪對大鼠血清中TNF-α、IL-1、IL-6水平影響 與對照組相比，1 d、7 d REM睡眠剝奪組血清中TNF-α、IL-1、IL-6升高(P<0.05)；與1 d REM睡眠剝奪組相比，7 d REM睡眠剝奪組血清中TNF-α、IL-1、IL-6升高(P<0.05)。見表3。

表3 3組大鼠血清中TNF-α、IL-1、IL-6水平比較Tab.3 Comparison of serum TNF-α，IL-1 and IL-6 levels in three groups of

2.3睡眠剝奪對大鼠海馬組織、前額葉皮質(zhì)區(qū)形態(tài)影響 對照組大鼠海馬組織、前額葉皮質(zhì)區(qū)細胞排列正常、分布均勻。1 d REM睡眠剝奪組海馬組織、前額葉皮質(zhì)區(qū)細胞均出現(xiàn)神經(jīng)元丟失、腫脹、變性和死亡，以及炎癥細胞浸潤和神經(jīng)膠質(zhì)細胞增殖現(xiàn)象。7 d REM睡眠剝奪組海馬組織、前額葉皮質(zhì)區(qū)細胞均出現(xiàn)大量神經(jīng)元丟失，腫脹，變性和死亡，以及炎癥細胞浸潤和神經(jīng)膠質(zhì)細胞增殖現(xiàn)象。見圖1。

圖1 HE檢測大鼠海馬組織、前額葉皮質(zhì)區(qū)形態(tài)Fig.1 Morphology of hippocampus and prefrontal cortex of rats detected by HENote:A，D.Control group;B，E.1 d REM sleep deprivation group;C，F(xiàn).7 d REM sleep deprivation group.The base drawing is enlarged drawing of the upper box respectively (magnification，×400).

2.4睡眠剝奪對大鼠海馬組織、前額葉皮質(zhì)區(qū)組織中miR-155表達水平影響 前額葉皮質(zhì)區(qū)組織中miR-155差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與對照組相比，1 d、7 d REM睡眠剝奪組海馬組織中miR-155升高(P<0.05)；與1 d REM睡眠剝奪組相比，7 d REM睡眠剝奪組海馬組織中miR-155升高(P<0.05)。見表4。

表4 3組大鼠海馬組織、前額葉皮質(zhì)區(qū)組織中miR-155表達水平比較Tab.4 Comparison of miR-155 expression levels in hippocampus and prefrontal cortex of three groups of

2.5睡眠剝奪對大鼠海馬組織、前額葉皮質(zhì)區(qū)組織中SOCS1、NF-κB蛋白表達影響 與對照組相比，1 d、7 d REM睡眠剝奪組海馬組織、前額葉皮質(zhì)區(qū)組織中SOCS1水平降低(P<0.05)；7 d REM睡眠剝奪組海馬組織、前額葉皮質(zhì)區(qū)組織中，1 d REM睡眠剝奪組前額葉皮質(zhì)區(qū)組織中NF-κB水平升高(P<0.05)。與1 d REM睡眠剝奪組相比，7 d REM睡眠剝奪組海馬組織、前額葉皮質(zhì)區(qū)組織中SOCS1水平降低(P<0.05)；NF-κB水平升高(P<0.05)。見圖2、表5。

表5 3組大鼠海馬組織、前額葉皮質(zhì)區(qū)組織中SOCS1、NF-κB蛋白表達比較Tab.5 Expressions of SOCS1 and NF-κB in hippocampus and prefrontal cortex of three groups of

圖2 Western blot檢測大鼠海馬組織、前額葉皮質(zhì)區(qū)SOCS1、NF-κB蛋白表達Fig.2 Western blot detection of SOCS1 and NF-κB protein expression in hippocampus and prefrontal cortex of ratsNote:1.Control group;2.1 d REM sleep deprivation group;3.7 d REM sleep deprivation group.

3 討論

睡眠剝奪是本身由于外在或內(nèi)在因素導致睡眠無法滿足，短暫時間的睡眠剝奪被認為與疾病、創(chuàng)傷等因素相關，是一種應激反應，可造成機體正常生理功能的紊亂，降低機體免疫功能[5]。睡眠剝奪是造成焦慮的原因之一，特別在女性中更為嚴重[6]；會降低人的注意力，且隨著任務時間的延長，關注度會持續(xù)變差[7]。 本研究發(fā)現(xiàn)與對照組相比，1 d、7 d REM睡眠剝奪組錯誤反應次數(shù)增加；與1 d REM睡眠剝奪組相比，7 d REM睡眠剝奪組錯誤反應次數(shù)增加。REM睡眠剝奪增加錯誤反應次數(shù)，使出錯概率增加，從而加重疾病進程。

免疫因子TNF-α、IL-1、IL-6在研究中應用廣泛。其中TNF-α作為一種細胞因子，由單核細胞或活化的吞噬細胞產(chǎn)生，具有免疫功能；在重度潰瘍性結腸炎大鼠模型中，抗TNF-α后可調(diào)節(jié)腸道菌群和免疫系統(tǒng)從而緩解疾病[8]。IL-1來源廣泛，是急性期免疫反應的主要調(diào)節(jié)因子，主要發(fā)生部位在神經(jīng)系統(tǒng)和脊髓中；當IL-1濃度較低時，主要發(fā)揮免疫功能，可促進T細胞、B細胞的生長及產(chǎn)生免疫球蛋白[9]。IL-6作為一種調(diào)控因子，可促進B細胞分化和分泌抗體，同時對機體感染和損傷刺激起調(diào)節(jié)作用；IL-6可影響肝癌患者病毒感染后免疫功能從而影響疾病[10]。本研究發(fā)現(xiàn)1 d REM睡眠剝奪組海馬組織、前額葉皮質(zhì)區(qū)細胞均出現(xiàn)神經(jīng)元丟失、腫脹、變性和死亡，以及炎癥細胞浸潤和神經(jīng)膠質(zhì)細胞增殖現(xiàn)象。7 d REM睡眠剝奪組海馬組織、前額葉皮質(zhì)區(qū)細胞均出現(xiàn)大量神經(jīng)元丟失，腫脹，變性和死亡，以及炎癥細胞浸潤和神經(jīng)膠質(zhì)細胞增殖現(xiàn)象。睡眠剝奪會引發(fā)腦部海馬、前額葉皮質(zhì)區(qū)組織細胞出現(xiàn)炎癥現(xiàn)象，會使各細胞變形、腫脹，嚴重使致死；且隨著睡眠剝奪時間的延長，各種不良癥狀加重。與對照組相比，1 d、7 d REM睡眠剝奪組血清中TNF-α、IL-1、IL-6升高；與1 d REM睡眠剝奪組相比，7 d REM睡眠剝奪組血清中TNF-α、IL-1、IL-6升高。睡眠剝奪不僅影響腦部神經(jīng)細胞，還導致全身免疫因子失衡，導致機體指標紊亂影響健康，且隨著時間的增加各項指標變化嚴重，但具體機制尚不明確。

miRNA參與固有免疫炎癥反應的研究是一個熱點問題，miR-155可調(diào)節(jié)CD4+Treg細胞的表達從而影響冠狀動脈斑塊穩(wěn)定性[11]；miR-155納米顆粒在鼠內(nèi)巨噬細胞的細胞攝取方面表現(xiàn)出優(yōu)異的能力，miR-155逃逸進入細胞質(zhì)和免疫抑制性腫瘤微環(huán)境中，可顯著抑制髓樣抑制細胞的形成并刺激T淋巴細胞在體外分泌更多的干擾素-γ細胞因子，提高CD4+和CD8+T細胞的浸潤和活化，從而調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境[12]。在類風濕性關節(jié)炎等慢性炎癥疾病中，miR-155抑制劑可降低TNF-α誘導的成纖維樣滑膜細胞增殖，并減弱TNF-α誘導的IL-6和IL-1β產(chǎn)生從而抑制疾病的進展[13]。miR-155調(diào)節(jié)免疫因子影響從而免疫功能，但具體通路有待驗證。本研究發(fā)現(xiàn)前額葉皮質(zhì)區(qū)組織中miR-155差異無統(tǒng)計學意義。與對照組相比，1 d、7 d REM睡眠剝奪組海馬組織中miR-155升高；與1 d REM睡眠剝奪組相比，7 d REM睡眠剝奪組海馬組織中miR-155升高。受部位影響，miR-155在睡眠剝奪中可能在海馬組織中發(fā)揮作用；miR-155表達升高使機體免疫功能降低，隨著免疫剝奪時間的延長，miR-155作用越強免疫功能低下越嚴重加重機體損傷。

SOCS1蛋白具有調(diào)節(jié)細胞因子、阻斷增強細胞因子作用，與自身免疫、超敏反應相關；是負調(diào)控因子，可抑制多種信號的傳導，可抑制NF-κB[14，15]。NF-κB可促進TNF-α、IL-1β及IFN-γ等的生成，這些因子又可反過來激活NF-κB信號通路，反復促進炎癥反應，進一步加重肝細胞損傷，使免疫性肝損傷加重[16，17]。SOCS1/NF-κB通路中激活SOCS1的表達可抑制NF-κB磷酸化從而抑制巨噬細胞M1極化葡聚糖硫酸鈉誘導的結腸炎[18]。miR-155表達升高可抑制SOCS1的表達從而激活NF-κB[19]。金雀異黃素通過miR-155/SOCS1介導的抑制臍靜脈內(nèi)皮細胞中NF-κB信號通路的作用來保護ox-LDL誘導的炎癥[20]。miR-155、SOCS1、NF-κB各因子均在免疫功能上發(fā)揮作用，通路可直接調(diào)控免疫相關因子。與對照組相比，1、7 d REM睡眠剝奪組海馬組織、前額葉皮質(zhì)區(qū)組織中SOCS1水平降低；7 d REM睡眠剝奪組海馬組織、前額葉皮質(zhì)區(qū)組織中，1 d REM睡眠剝奪組前額葉皮質(zhì)區(qū)組織中NF-κB水平升高。與1 d REM睡眠剝奪組相比，7 d REM睡眠剝奪組海馬組織、前額葉皮質(zhì)區(qū)組織中SOCS1水平降低；NF-κB水平升高。miR-155表達升高可抑制SOCS1的表達，激活NF-κB水平使免疫因子水平升高，降低免疫功能；且隨著時間的延長，該影響作用越明顯，從而加重睡眠剝奪。

綜上所述，miR-155表達升高可抑制SOCS1表達，從而激活NF-κB，使免疫因子水平升高，降低睡眠剝奪后免疫功能，使機體免疫失衡。但免疫受多條通路的影響，其中miR-155/SOCS1/NF-κB只是其中的一條通路，其他通路也可能對該通路造成影響，分析通路間的相互作用對免疫的影響可能使文章說服力更強。因此，下一步就miR-155/SOCS1/NF-κB通路的緊密通路做進一步研究。