王志豪 龍 婷 陳 秀 李作孝

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，瀘州 646000)

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis,MS)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病，其病因和發(fā)病機制尚未明確，可能與病毒感染、遺傳因素、環(huán)境因素、自身免疫因素等有關(guān)，而腸道微生態(tài)改變可能就是其中一個重要的環(huán)境因素。腸道菌群作為腸道微生態(tài)的核心組成部分，可通過微生物-腸-腦軸調(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育與功能，同時在疾病進展中發(fā)揮致病和保護作用。腸道菌群參與機體多種生理生化過程，如免疫、營養(yǎng)、神經(jīng)內(nèi)分泌等。菌群的更替、紊亂與腸道慢性炎癥性疾病、MS、帕金森病、抑郁癥、焦慮癥、腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1，2]。Jangi等[3]研究發(fā)現(xiàn)MS患者腸道微生物種屬組成、菌群生物多樣性均與健康人存在差異。Cekanaviciute等[4]也發(fā)現(xiàn)用MS衍生的糞便定植的無菌小鼠具有更嚴重的實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)癥狀。雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片作為益生菌代表，具有調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、維持腸道微生態(tài)穩(wěn)定的作用，能抑制腸道致病菌，改善腸道功能紊亂。研究表明益生菌對帕金森病、阿爾茨海默病、腦血管病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有一定治療作用[5]。EAE模型是目前研究MS最經(jīng)典的動物模型，因此，本實驗旨在研究EAE小鼠腸道菌群的變化，通過益生菌干預(yù)改變EAE小鼠腸道菌群，觀察其對EAE小鼠的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 30只SPF級C57BL/6雌性小鼠(6～8周齡，18～22 g)購于北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，許可證號：[SCXK(京)2016-0002]，飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學(xué)忠山校區(qū)SPF級動物房內(nèi)，自由攝入普通飼料及飲用無菌蒸餾水，飼養(yǎng)室溫(24±2)℃，每12 h明暗交替1次，實驗過程符合《實驗動物飼養(yǎng)和使用條例》。

1.1.2益生菌及主要試劑 雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片(內(nèi)蒙古雙奇藥業(yè)公司，批號：S19980004)；MOG35-55多肽(上海吉爾生化有限公司)；完全弗氏佐劑、百日咳毒素、ELISA試劑盒(美國Sigma公司)；卡介苗凍干粉 (上海瑞楚生物科技有限公司)；luxol fast blue(LFB)染液試劑盒、兔抗TLR4、NF-κBp65抗體、山羊抗兔二抗(Aspen公司)；雙歧桿菌培養(yǎng)基、乳桿菌選擇培養(yǎng)基、腸球菌培養(yǎng)基(北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司)；梭菌培養(yǎng)基、擬桿菌培養(yǎng)基(青島海博生物技術(shù)有限公司)；腸桿菌培養(yǎng)基、消化鏈球菌培養(yǎng)基(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；真桿菌培養(yǎng)基(卡邁舒上海生物科技有限公司)；酵母菌培養(yǎng)基(北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院)；引物設(shè)計合成(武漢金開瑞生物工程有限公司)；RT-PCR試劑盒(ELK Biotechnology公司)。

1.2方法

1.2.1EAE模型制備、分組及益生菌干預(yù)方法 將30只小鼠隨機分為正常對照組、EAE模型組、益生菌組，造模前各組小鼠均禁食、禁飲24 h，將MOG35-55溶于PBS，稀釋至3 mg/ml，卡介苗溶于完全弗氏佐劑，濃度為10 g/L。將上述2種液體1∶1 混勻至乳化劑。用1 ml注射器分別在EAE模型組、益生菌組小鼠背部皮下注射誘導(dǎo)乳化劑0.2 ml(脊柱兩側(cè)任選4點各0.05 ml)制作EAE模型，正常對照組注射等量生理鹽水。在造模當(dāng)天及2 d后，造模小鼠均腹腔注射0.5 ml百日咳菌稀釋液，正常對照組注射等量生理鹽水。益生菌組從造模次日開始以0.4 ml/d的益生菌溶液灌胃，正常對照組、EAE模型組每天灌胃給予等量生理鹽水，發(fā)病高峰期(神經(jīng)功能評分連續(xù)3 d無變化為高峰期)處死EAE模型組、益生菌組小鼠，正常對照組小鼠觀察至第28天處死，取糞便、腦組織進行后續(xù)實驗。

1.2.2小鼠發(fā)病情況觀察 造模當(dāng)日起每天早8∶00 觀察并記錄小鼠體質(zhì)量變化、毛發(fā)光澤情況，并根據(jù)Kono5分評分法進行神經(jīng)功能評分。評分細則如下：0分為不發(fā)病；1分為尾巴無力；2分為輕微后肢無力；3分為嚴重后肢麻痹；4分為四肢麻痹；5分為瀕死或死亡。

1.2.3LFB染色 取腦組織側(cè)腦室周圍組織常規(guī)石蠟切片，片厚6 μm，將石蠟切片脫蠟，放入95%乙醇中醇化5 min，然后放入LFB染液中60℃水浴24 h，醇化、分化、鏡檢、封片。

1.2.4腸道菌群檢測 分別采集3組小鼠發(fā)病高峰期的新鮮糞便樣本10 g，快速置于糞便厭氧裝置，-80℃凍存。檢測時取0.5 g糞便標本，用肉湯10倍梯度稀釋(1×10-7～1×10-2) 。取20 μl菌液滴種于腸桿菌、腸球菌、葡萄球菌、酵母菌、擬桿菌、雙歧桿菌、消化鏈球菌、乳酸桿菌、真桿菌及梭菌的選擇性培養(yǎng)基。前4種為需氧菌，置于37℃普通培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，其余為厭氧菌，置于厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 72 h。采用日本光岡腸道菌群分析法進行定性定量檢測，以API生化鑒定系統(tǒng)的厭氧菌三級鑒定法鑒定菌種，鑒定細菌至屬水平，觀察結(jié)果并計數(shù)，以每g濕糞的菌落形成單位(colony forming unit，CFU) 的對數(shù)值表示。B/E值為雙歧桿菌與大腸桿菌數(shù)量的比值，用來反映腸道的功能狀況。B/E值>1表示腸道定植抗力正常；B/E值<1表示腸道定植抗力降低，菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生紊亂。

1.2.5ELISA檢測IL-1β、IL-6、TNF-α表達 采用ELISA試劑盒檢測各指標水平，按說明書進行操作。

1.2.6免疫組織化學(xué)法(IHC)檢測NF-κBp65核表達 腦組織切片脫蠟至水，置于EDTA緩沖液中微波加熱行抗原修復(fù)，3%H2O2溶液室溫孵育10 min(以清除內(nèi)源性過氧化物酶活性)，5% BSA封閉 20 min 后滴加稀釋的一抗(1∶50)4℃過夜，滴加二抗(1∶1 000)37℃孵育50 min，PBS液漂洗，DAB顯色，脫水透明封片。在光鏡下放大100倍攝取圖像，輸入圖像分析系Image Pro Plus6.0內(nèi)對圖像進行灰度變換，使染色陽性區(qū)域與背景明顯分開，自動測量陽性面積、積分光密度，并計算平均光密度值，進行半定量分析處理，取其均值為光密度值，表示NF-κBp65的相對表達量。

1.2.7RT-PCR檢測TLR4和NF-κBp65 mRNA表達 采用TRIpure法提取各組小鼠腦組織RNA并行反轉(zhuǎn)錄，根據(jù)M-MLVReverse Transcriptas試劑盒說明書操作得到cDNA模板，利用QuFast SYBR Green PCR Master Mix熒光染料PCR擴增R-MBP的基因片段。PCR擴增引物序列，TLR4 F：5′-ACACTTTATTCAGAGCCGTTGGT-3′,R:5′-CAGGTCCAAGTTGCCGTTTC-3′,NF-κBp65 F:5′-ACTATGAGGCTGACCTCTGCC-3′,R:5′-TCTGGATTCGCTGGCTA-

ATG-3′,內(nèi)參M-GAPDH F:5′-TGAAGGGTGGAGCCAAAAG-3′，R:5′-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3′。反應(yīng)程序為：95℃ 30 s，95℃ 5 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s， 40個循環(huán)。反應(yīng)液為：2×Master Mix 5.0 μl，引物工作液(2.5 μmol/L) 1.0 μl，上、下游引物各1.0 μl，ddH2O 2.0 μl，Rox 1.0 μl。采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量，ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，ΔΔCt=ΔCt實驗組-ΔCt對照組。

1.2.8Western blot檢測TLR4和NF-κBp65蛋白表達 向各組小鼠腦組織加入裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，除去封閉液，加入用稀釋液稀釋好的一抗4℃孵育過夜?；厥找严♂尩囊豢梗琓BST清洗3次，每次5 min，加入二抗稀釋液，室溫孵育 30 min，TBST在室溫下?lián)u床上清洗4次，每次5 min，滴加新鮮配制的ECL 混合溶液到膜的蛋白面，暗室中曝光，根據(jù)不同的光強度調(diào)整曝光條件，顯影、定影，采用AlphaEaseFC軟件處理系統(tǒng)分析目標條帶的光密度值。

2 結(jié)果

2.1各組小鼠一般情況及神經(jīng)功能缺損評價 正常對照組小鼠均未發(fā)病。EAE模型組小鼠造模成功后精神萎靡、毛發(fā)光澤度降低、脫毛、食欲下降、體質(zhì)量減輕，癥狀逐漸加重，出現(xiàn)尾部下垂、步態(tài)不穩(wěn)、后肢行走無力甚至癱瘓。益生菌組小鼠也表現(xiàn)出與EAE模型組小鼠同樣的癥狀，但較EAE模型組癥狀輕。益生菌組小鼠發(fā)病潛伏期、高峰期較EAE模型組均有延長，神經(jīng)功能評分較EAE模型組降低(P<0.05)。各組小鼠發(fā)病潛伏期、高峰期及高峰期神經(jīng)功能障礙評分結(jié)果，見表1、圖1。

圖1 神經(jīng)功能缺損評分變化示意圖Fig.1 Schematic diagram of changes in neurological defi-cit scores

表1 兩組發(fā)病潛伏期、高峰期、高峰期神經(jīng)功能障礙評分比較Tab.1 Comparison of latent period，peak period and neuro-functional deficiency scores in two groups

2.2各組小鼠腦組織病理變化 正常對照組小鼠腦組織LFB染色髓鞘結(jié)構(gòu)清晰。EAE模型組、益生菌組小鼠均出現(xiàn)不同程度的脫髓鞘，髓鞘結(jié)構(gòu)排列稀疏、紊亂，可見不同程度的低染區(qū)域及空泡狀結(jié)構(gòu)，益生菌組上述變化較EAE模型組輕。見圖2。

圖2 各組小鼠腦組織LFB染色情況(×200)Fig.2 Demyelization in brain tissues of mice in different groups by LFB staining(×200)Note:A.Normal control group;B.EAE model group;C.Probiotic group.

2.3各組小鼠腸道菌群變化 在培養(yǎng)的10種腸道主要細菌中，EAE模型組與正常對照組相比，擬桿菌數(shù)量減少(P<0.05)。益生菌組與EAE模型組相比，雙歧桿菌、乳桿菌數(shù)量增加(P<0.05)。益生菌組與EAE模型組相比，B/E值上升(P<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠腸道菌群值和B/E值比較濕糞)Tab.2 Comparison of intestinal flora value and B/E value of mice in each CFU/g wet feces)

2.4各組小鼠IL-1β、IL-6、TNF-α表達情況 EAE模型組與正常對照組相比，IL-1β、IL-6、TNF-α表達上升(P<0.05)，益生菌組和EAE模型組相比，IL-1β、IL-6、TNF-α表達降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組小鼠腦組織IL-1β、IL-6、TNF-α含量比較Tab.3 Comparison of IL-1β，IL-6，TNF-α contents in brain tissue of each group of

2.5各組小鼠NF-κBp65核表達情況 EAE模型組(69.09±3.23)和正常對照組(20.41±1.47)相比，NF-κBp65核表達上升(P<0.05)；益生菌組(52.69±1.96)與EAE模型組相比，NF-κBp65核表達降低(P<0.01)。見圖3。

圖3 各組小鼠腦組織NF-κBp65細胞核表達的IHC檢測結(jié)果(×200)Fig.3 IHC results of nuclear expression of NF-κBp65 cells in brain tissue of mice in each group(×200)Note:A.Normal control group;B.EAE model group;C.Probiotic group.

2.6各組小鼠TLR4、NF-κBp65 mRNA表達情況 EAE模型組與正常對照組相比，TLR4和NF-κBp65 mRNA表達上升(P<0.05)；益生菌組與EAE模型組相比，TLR4和NF-κBp65 mRNA表達降低(P<0.05)。見表4。

表4 各組小鼠TLR4和NF-κBp65 mRNA表達Tab.4 Expressions of TLR4 and NF-κBp65 mRNA in each groups of

2.7各組小鼠TLR4、NF-κBp65蛋白表達情況 EAE模型組與正常對照組相比，TLR4和NF-κBp65蛋白表達上升(P<0.05)；益生菌組與EAE模型組相比，TLR4和NF-κBp65蛋白表達降低(P<0.05)。見表5、圖4。

表5 各組小鼠TLR4和NF-κBp65蛋白表達Tab.5 Expressions of TLR4 and NF-κBp65 proteins in each group of

圖4 Western blot檢測各組小鼠腦組織蛋白表達Fig.4 Western blot analysis of brain tissue protein expre-ssions in each group of miceNote:1.Normal control group;2.EAE model group;3.Probiotic group.

3 討論

腸道微生態(tài)是人體最大且最復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，其核心部分是腸道菌群，在漫長的協(xié)同進化過程中，腸道菌群與宿主形成了緊密的共生關(guān)系。腸道菌群與中樞神經(jīng)系統(tǒng)密切相關(guān)，并對腸道的功能調(diào)節(jié)和穩(wěn)態(tài)維持起重要作用。鑒于腸道微生物群和宿主的復(fù)雜關(guān)系，近年來提出了一種新的理念，即微生物-腦-腸軸，由中樞神經(jīng)系統(tǒng)、自主神經(jīng)和腸神經(jīng)系統(tǒng)共同形成神經(jīng)-內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)，可局部調(diào)控、整合和處理信息[6]。越來越多的研究證明腸道微生物群和宿主的共生相互作用能誘導(dǎo)自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展，如MS和EAE[7]。MS是一種自身免疫性疾病，其自身免疫起源尚不清楚，誘發(fā)炎癥因素在中樞神經(jīng)系統(tǒng)或外周亦不明確，Oksenberg等[8]研究表明，在單卵雙胞胎中，MS占25%，遺傳和環(huán)境因素都可能導(dǎo)致該病發(fā)生，而腸道菌群就是其中1個不可忽略的環(huán)境因素。

本研究表明，EAE模型組的擬桿菌含量明顯低于正常對照組，這與Jangi等[3]采用16S基因測序法研究MS患者腸道菌群變化結(jié)果基本一致。擬桿菌正常寄居于人和動物的腸道、上呼吸道和生殖道，長期應(yīng)用廣譜抗生素、激素、免疫抑制劑等均可導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)或免疫功能紊亂，從而引發(fā)內(nèi)源性感染[9]。EAE模型組B/E<1表明EAE小鼠腸道菌群平衡失調(diào)，腸道定植能力下降。腸道菌群紊亂可破壞腸道屏障，增加其通透性，使各種細菌及其代謝產(chǎn)物易于透過腸道屏障作用于全身，參與多種疾病的發(fā)病及病理生理過程；而腸道定植能力是機體免疫的重要組成部分，其水平下降可增加腸道感染風(fēng)險。Riccio等[10]研究表明，飲食可以影響復(fù)發(fā)-緩解型和原發(fā)性MS的嚴重程度，高鹽、動物脂肪、紅肉、碳水化合物可能會加重癥狀，蔬菜、水果、益生元和益生菌可通過保持健康的腸道菌群以減輕癥狀。由此說明通過改變共生腸道菌群的組成、數(shù)量、結(jié)構(gòu)可能影響MS的病程[11]。雙歧桿菌、乳桿菌是腸道微生物中最重要的益生菌，對維持腸道菌群平衡發(fā)揮重要作用，雙歧桿菌是一種生理性有益菌，具有抗腫瘤、增強免疫、改善胃腸道功能等多種重要的生理功能[12]。其可在腸黏膜表面形成生物學(xué)屏障、機械屏障，可降低腸道pH值，此外還可減少腸道內(nèi)有害物質(zhì)如過氧化氫、羥基苯等的產(chǎn)生[13，14]。乳桿菌可降低腸道pH值，為有益菌群提供適宜的生存環(huán)境，并能抑制潛在致病菌的生長，有助于維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定；同時能恢復(fù)細胞因子，維持細胞因子平衡[15]；此外，乳桿菌還可減少腸道中炎癥介質(zhì)的釋放，調(diào)節(jié)腸道免疫功能，進而減輕腸道炎癥反應(yīng)[16]。提示益生菌可抑制腸道內(nèi)源性及外源性潛在致病菌對腸上皮細胞的黏附和定植；同時，益生菌還能通過爭奪營養(yǎng)、調(diào)節(jié)腸道pH值、產(chǎn)生具有廣譜抗菌作用的物質(zhì)等多種生物拮抗功能，對腸道內(nèi)致病菌起抑菌或殺菌作用，對維持腸道菌群的穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)腸道功能至關(guān)重要[17]。本研究結(jié)果顯示，益生菌組小鼠腸道中雙歧桿菌、乳桿菌、B/E值明顯高于EAE模型組，表明益生菌能有效改善EAE小鼠腸道微生態(tài)環(huán)境，提高腸道定植抗力。

Varga等[18]和Garcia等[19]研究表明腸道中有害菌群產(chǎn)生的毒素能被腸道吸收進入血流，引起MS樣癥狀，這些毒素可與受體結(jié)合后存在于大腦的血管系統(tǒng)和有髓鞘、無髓鞘的腦組織區(qū)域[20]。過量的腸道細菌及其產(chǎn)物可通過腸道黏膜屏障進入腸系膜淋巴結(jié)、血液或其他腸外臟器，并能透過血腦屏障進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，通過一系列的炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)神經(jīng)細胞凋亡與氧化損傷，最終導(dǎo)致腦損傷[21-23]。TLR4/NF-κB信號通路是調(diào)節(jié)炎癥細胞因子產(chǎn)生的關(guān)鍵途徑。TLR4是細菌LPS的受體，能將LPS轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的信號迅速傳至核內(nèi)，激活位于下游樞紐位置的NF-κB，活化的NF-κB入細胞核促進炎癥細胞因子的合成和釋放。既往研究發(fā)現(xiàn)，TLR4在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達水平在EAE的整個疾病進程中始終呈持續(xù)升高狀態(tài)[24]。本研究也顯示EAE模型組TLR4和NF-κBp65在mRNA和蛋白水平上表達均顯著升高，NF-κBp65核表達增加，NF-κB下游炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α含量增加，提示TLR4/NF-κB信號通路的激活可能參與EAE的發(fā)病過程。抑制TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對NF-кB的激活、對疾病的發(fā)病、進展均有一定抑制作用[25]。本研究顯示，益生菌組小鼠通過益生菌干預(yù)調(diào)節(jié)腸道菌群后，TLR4和NF-κBp65在mRNA和蛋白水平上表達顯著下調(diào)，NF-κBp65核表達減少，IL-1β、IL-6、TNF-α含量也明顯減少，提示益生菌可抑制TLR4/NF-κB信號通路。

益生菌具有調(diào)節(jié)腸道菌群，維持腸道穩(wěn)態(tài)作用。益生菌組小鼠發(fā)病潛伏期、高峰期延長，臨床癥狀輕，神經(jīng)功能評分降低，腦組織脫髓鞘輕。上述結(jié)果均表明，益生菌調(diào)節(jié)腸道中雙歧桿菌、乳桿菌等有益菌群，提高了腸道定植抗力，可發(fā)揮治療EAE作用，對改善EAE的臨床癥狀具有一定的治療意義。推測其作用途徑可能是通過抑制TLR4/NF-κB信號通路，進一步抑制下游炎癥因子釋放的級聯(lián)效應(yīng)。對于EAE小鼠腸道菌群的變化及其代謝產(chǎn)物如何調(diào)控TLR4/NF-κB信號通路，本課題組將于后續(xù)實驗進一步研究。