萬 紅 李寶林 楊 平 李婷婷

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗部，瀘州 646000)

自身免疫性血小板減少癥是一種臨床上常見的獲得性器官特異性自身免疫性疾病，其具有血小板減少、皮膚黏膜出血等特征，已有研究證實此類患者多存在免疫功能紊亂[1，2]。自身免疫性血小板減少癥的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，隨著高通量基因分型技術(shù)和現(xiàn)代信息技術(shù)的飛速發(fā)展，人們對自身免疫性疾病患者基因突變的研究也逐漸深入，自身免疫性血小板減少癥的基因突變已成為研究的重點[3]。有研究認為，非受體型蛋白酪氨酸磷酸酶22(non-receptor protein tyrosine phosphatase 22，PTPN22)可編碼淋巴酪氨酸磷酸酶，影響T細胞信號，對機體免疫功能發(fā)揮調(diào)控作用，且該基因多態(tài)性與橋本甲狀腺炎、Graves病等多種自身免疫性疾病的發(fā)生均有密切關(guān)系[4]。TNF-α啟動子區(qū)863位點基因多態(tài)性可通過調(diào)控TNF-α的表達影響炎癥和免疫反應(yīng)，也被證實與Graves病等多種自身免疫性疾病的發(fā)生相關(guān)[5]。但目前關(guān)于PTPN22、TNF-α基因多態(tài)性與漢族人群自身免疫性血小板減少癥的關(guān)系報道尚少，仍需深入研究。鑒于此，本研究選取漢族人群中100例自身免疫性血小板減少癥患者和300例健康志愿者進行對照分析，探討PTPN22 1 123位點、TNF-α 863位點基因多態(tài)性與漢族人群自身免疫性血小板減少癥發(fā)生風險的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1臨床資料 選取2018年1月～2019年5月本院收治的漢族自身免疫性血小板減少癥患者100例，配對選取同時間段本院體檢中心接收的300例漢族健康志愿者，分別記為疾病組和健康組。疾病組中男性54例、女性46例，年齡24～78歲，平均年齡(55.41±9.15)歲，均為初診患者，免疫增強劑(卡介苗、胸腺素、免疫核糖核酸等)應(yīng)用史16例、病毒(肝炎、人免疫缺陷病毒等)感染者共7例、具有遺傳史患者10例；健康組中男性160例、女性140例，年齡22～78歲，平均年齡(55.29±9.20)歲，2組性別與平均年齡資料數(shù)據(jù)經(jīng)對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。納入標準：疾病組均符合自身免疫性血小板減少癥的診斷標準且均為初診患者，健康組均為同時間段醫(yī)院體檢中心接收的健康志愿者[6]；排除標準：合并其他類型自身免疫性疾病者，存在先天性免疫功能紊亂者，伴有精神、認知或意識障礙者，理解能力差難以配合完成本研究者，存在藥物濫用史、吸毒史、傳染病史等，罹患惡性腫瘤者，合并其他系統(tǒng)性疾病者，近6個月存在心臟重大手術(shù)史者。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準，所有受檢者自愿簽署知情同意書。

1.1.2試劑和儀器 DNA提取試劑盒購自美國Promega公司；生物芯片和HOTSTART Taq酶均購自大連寶生物科技有限公司；純化瓊脂、iPLEX反應(yīng)試劑均購自杭州四季青生物科技有限公司；PTPN22、TNF-α基因PCR反應(yīng)引物均由美國PE-Cetus公司設(shè)計并合成。

Optima MAX-TL型臺式離心機購自美國貝克曼庫爾特有限公司；HH·S11-4型恒溫水浴鍋購自常州金壇精達儀器制造有限公司；7900HT Fast型聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀購自美國ABI公司；Mars-550型質(zhì)譜檢測儀購自聚光科技(杭州)股份有限公司；TU-1900型紫外線分光光度計購自北京普析通用儀器有限責任公司；UV-1000型紫外透射儀購自上海嘉鵬科技有限公司。

1.2方法

1.2.1準備工作 真空抗凝管抽取受試者外周血，DNA提取試劑盒提取基因組DNA，需注意嚴格按照試劑盒說明書操作。將提取的DNA分裝，保存于-20℃冰箱備用。2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA純度及其完整性。

1.2.2PTPN22 1 123位點基因多態(tài)性檢測方法 采用聚合酶鏈反應(yīng)-基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)檢測PTPN22 1 123位點基因多態(tài)性，DNA濃度調(diào)整為50 ng/μl，DNA純度260 nm處波長的密度值與280 nm處波長的光密度值的比值為1.7～2.0，PCR反應(yīng)體系：0.5 μl 10×buffer(預(yù)混20 mmol/L氯化鎂)+0.4 μl氯化鎂+0.1 μl dNTP mix+1.0 μl Primer mix+0.1 μl HOTSTART Taq酶+1.9 μl超純水+1.0 μl DNA，共5 μl，反應(yīng)程序：94℃(15 s)，94℃(20 s)，56℃(30 s)，72℃(1 min)，共進行45個循環(huán)，然后72℃(3 min)，4℃(終止)。堿性磷酸酶處理方法：在降解擴增反應(yīng)中使用過量的dNTP，確保后續(xù)延伸反應(yīng)中僅延伸1個堿基，反應(yīng)程序為：37℃(40 min)，85℃(5 min)，12℃(終止)。將配置好的iPLEX反應(yīng)液加入上述體系，按照如下程序進行延伸反應(yīng)：94℃(30 s)，94℃(5 s)，52℃(5 s)，80℃(5 s)，共進行45個循環(huán)，然后72℃(3 min)，12℃(終止)。對延伸反應(yīng)所得產(chǎn)物采用樹脂除鹽純化處理，芯片點樣，檢測結(jié)果利用Typer4.0軟件進行分析，獲得分型結(jié)果。

1.2.3TNF-α 863位點基因多態(tài)性檢測方法 采用多聚酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性方法檢測TNF-α 863位點基因多態(tài)性，PCR擴增反應(yīng)體系為：4 μl DNA模板+3 μl 10×buffer+1.5 μl氯化鎂+3 μl 10 mmol/L dNTP+0.5 μl上游引物+0.5 μl下游引物+1 μl 5 U/μl Taq酶，加超純水至30 μl。擴增反應(yīng)程序：94℃(2 min)，94℃(20 s)，56℃(20 s)，72℃(40 s)，共進行35個循環(huán)，然后72℃(10 min)。限制性內(nèi)切酶反應(yīng)體系：3.9 μl 去離子水+1 μl 10×buffer+5 μl PCR擴增反應(yīng)產(chǎn)物+0.1 μl TaiI限制酶，65℃(4 h)。將所得產(chǎn)物采用3.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，并于紫外透射儀下觀察結(jié)果，其中野生型(CC)不能被酶切，純合變異型(AA)為21 bp和104 bp 2個片段，雜合變異型(AC)為21 bp、104 bp和125 bp 3個片段。

1.2.4觀察指標 ①對比2組PTPN22 1 123位點基因多態(tài)性；②對比2組TNF-α 863位點基因多態(tài)性；③分析PTPN22 1 123位點、TNF-α 863位點等位基因頻率與漢族人群自身免疫性血小板減少癥的關(guān)系，統(tǒng)計比值比(OR)、95%可信區(qū)間(95%CI)。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 SPSS22.0軟件作為統(tǒng)計學(xué)分析工具，計數(shù)資料以“%”描述，分布資料采用秩和檢驗，2樣本間計數(shù)資料采用χ2檢驗；以Logistic回歸分析明確PTPN22 1 123位點、TNF-α 863位點等位基因頻率與漢族人群自身免疫性血小板減少癥的關(guān)系，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1疾病組與健康組PTPN22 1 123位點基因多態(tài)性對比 疾病組PTPN22 1 123位點CC、CG、GG基因型分布與健康組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且其G等位基因頻率明顯高于健康組(P<0.05)，見表1、圖1～3。

表1 疾病組與健康組PTPN22 1 123位點基因多態(tài)性對比[例(%)]Tab.1 Comparison of PTPN22 1 123 gene polymorphism between disease group and healthy group[n(%)]

圖1 PTPN22基因啟動子區(qū)1 123位點序列特異性引物PCR擴增結(jié)果Fig.1 Results of PCR amplification with sequence specific primers at 1 123 site in promoter regionNote:M.Marker；3.CC homozygote；7.CG heterozygote；others are GG homozygote.

圖2 PTPN22基因檢測PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoresis results of PCR products of PTPN22 gene detectionNote:1-6 are GG homozygote.

圖3 PTPN22基因啟動子區(qū)1 123位點3種基因型測序圖Fig.3 Sequencing map of three genotypes at 1 123 site of PTPN22 gene promoter

2.2疾病組與健康組TNF-α 863位點基因多態(tài)性對比 疾病組TNF-α 863位點CC、CA、AA基因型分布與健康組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且其A等位基因頻率明顯高于健康組(P<0.05)，見表2、圖4～6。

表2 疾病組與健康組TNF-α 863位點基因多態(tài)性對比[例(%)]Tab.2 Comparison of TNF-α 863 gene polymorphism between disease group and healthy group[n(%)]

圖4 TNF-α基因啟動子區(qū)863位點序列特異性引物PCR擴增結(jié)果Fig.4 PCR amplification results of 863 site in promoter region of TNF-α gene

圖5 TNF-α基因檢測PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.5 Electrophoresis results of PCR products of TNF-α gene detectionNote:M.Marker;1-3.CA heterozygotes;4.AA homozygotes;5,6.CC homozygotes.

圖6 TNF-α基因啟動子區(qū)863位點測序圖Fig.6 Sequencing map of 863 site in promoter region of TNF-α gene

2.3Logistic回歸分析 經(jīng)Logistic回歸分析可知，PTPN22 1 123位點G突變、TNF-α 863位點A突變、免疫增強劑應(yīng)用史、病毒感染、遺傳史均是漢族人群自身免疫性血小板減少癥的危險因素(OR=6.903、7.965、5.966、6.994、6.443，P<0.05)，見表3。

表3 Logistic回歸分析Tab.3 Logistic regression analysis

3 討論

自身免疫性血小板減少癥主要由血小板產(chǎn)生不足及消耗過多引起，二者均由免疫球蛋白G抗血小板抗體介導(dǎo)[7]。研究認為，自身免疫的主要靶點是血小板糖蛋白，而與自身免疫異常所致的免疫球蛋白G抗血小板抗體水平和功能紊亂有關(guān)的因素均可增加自身免疫性血小板減少癥的發(fā)生風險，進而導(dǎo)致嚴重危害[8]?；蚨鄳B(tài)性是近年來臨床上關(guān)于此類疾病發(fā)生機制的研究熱點，影響自身免疫系統(tǒng)功能的多種基因的多個位點的基因型分布和等位基因頻率均在自身免疫性疾病患者中存在異常[9-11]。研究顯示，分析自身免疫性血小板減少癥遺傳易感性的危險因素和相關(guān)基因多態(tài)性對控制該病的發(fā)生風險和指導(dǎo)此類疾病新藥的研發(fā)具有重要意義[12]。

本研究顯示，疾病組PTPN22 1 123位點CC、CG、GG基因型分布與健康組有顯著差異(P<0.05)，且其G等位基因頻率明顯高于健康組，可知PTPN22 1 123基因多態(tài)性在漢族人群自身免疫性血小板減少癥患者中存在異常。Logistic回歸分析顯示，PTPN22 1 123位點G突變是漢族人群自身免疫性血小板減少癥的獨立危險因素，證實該位點G突變可增加漢族人群患此類疾病的發(fā)生風險。PTPN22基因編碼產(chǎn)物可對T細胞活化信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生負調(diào)控作用，若1 123位點T基因突變，則其活化程度增強，干擾機體免疫耐受能力，從而誘發(fā)自身免疫性疾病，增加自身免疫性血小板減少癥的發(fā)生風險。既往研究表明，PTPN22 1 123位點基因多態(tài)性與自身免疫性血小板減少癥的遺傳易感性相關(guān)；另有研究指出，PTPN22 1 123位點優(yōu)勢等位基因為C，正常人群中C等位基因頻率遠高于G等位基因頻率，而自身免疫性疾病患者中PTPN22 1 123位點G等位基因頻率明顯高于健康志愿者，與本研究結(jié)果相符，共同證實PTPN22 1 123位點G突變可增加自身免疫性血小板減少癥的發(fā)生風險[13，14]。另有研究指出，自身免疫性血小板減少癥患者中PTPN22 1 123位點基因多態(tài)性與健康志愿者相近，與本研究結(jié)論不符[15]。分析其原因為：本研究所選對象均為漢族人，而上述研究均未明確種族，不同種族人群中PTPN22 1 123位點的基因多態(tài)性可能有明顯差異；2項研究所選病例性別分布可能存在差異，而性別可能會影響性激素水平進而影響自身免疫功能。

此外，本研究還指出疾病組TNF-α 863位點CC、CA、AA基因型分布與健康組有顯著差異(P<0.05)，且其A等位基因頻率明顯高于健康組，經(jīng)Logistic回歸分析證實TNF-α 863位點A突變是漢族人群自身免疫性血小板減少癥的獨立危險因素，提示TNF-α 863位點基因多態(tài)性與漢族人群患此類疾病的遺傳易感性密切相關(guān)，且前者A突變可顯著增加該病的發(fā)生風險。既往關(guān)于TNF-α 863位點基因多態(tài)性與自身免疫性血小板減少癥的相關(guān)性報道尚少，但王迎雪等[16]的研究證實TNF-α 863位點A突變可增加免疫性甲狀腺疾病的發(fā)生風險。另有研究指出，健康志愿者中TNF-α 863位點C為優(yōu)勢等位基因，一旦發(fā)生A突變，則可促進局部組織促炎癥因子的表達，誘發(fā)炎癥反應(yīng)和免疫紊亂[17]。TNF-α的基因多態(tài)性多集中于啟動子區(qū)，863位點A突變可與環(huán)境、病毒感染等多種因素共同作用增強自身免疫性疾病的易感性，還可影響患者的病情嚴重程度。由此可知，TNF-α 863位點A突變可增加漢族人群自身免疫性血小板減少癥的發(fā)生風險，其作用機制仍需進一步探討。

本研究Logistic回歸分析結(jié)果顯示，免疫增強劑應(yīng)用史、病毒感染、遺傳史均是漢族人群自身免疫性血小板減少癥的危險因素，提示上述因素均可增加漢族人群患此類疾病的風險。結(jié)合國內(nèi)外相關(guān)報道分析其中原因為：免疫增強劑應(yīng)用可促進機體免疫系統(tǒng)活化，若未嚴格監(jiān)控可能導(dǎo)致免疫系統(tǒng)紊亂，誘發(fā)自身免疫性血小板減少癥；人細胞病毒B19、新布尼亞病毒等病毒感染均可引發(fā)免疫功能紊亂，并介導(dǎo)免疫相關(guān)性出血性疾病，增加自身免疫性血小板減少癥發(fā)生概率；遺傳史是此類疾病的重要危險因素之一，推測與基因多態(tài)性異常緊密相關(guān)[18-20]。

綜上所述，PTPN22 1 123位點、TNF-α 863位點基因多態(tài)性與漢族人群自身免疫性血小板減少癥的發(fā)生密切相關(guān)，且PTPN22 1 123位點T突變、TNF-α863位點A突變、免疫增強劑應(yīng)用史、病毒感染、遺傳史等均是漢族人群自身免疫性血小板減少癥的危險因素，需加強關(guān)注和控制力度。