甘 露 周弟彌 張 磊 陳 琳

(南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，衡陽 421001)

癲癇是全球常見的慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚未明確。任何引起大腦生理結(jié)構(gòu)或功能紊亂的因素均可能導(dǎo)致癲癇，威脅各年齡階段人群[1,2]。研究報(bào)道，全球約有7 000萬癲癇患者，我國癲癇患者約占全球的13%[3]。目前，癲癇的主要治療方式是抗癲癇藥物治療，但仍有25%～30%的患者發(fā)展為耐藥性癲癇，治療效果并不理想[4]。尋找治療癲癇的新方法成為急需解決的問題。硫氧還蛋白(thioredoxin，Trx)是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的抗氧化分子，可通過抗氧化效應(yīng)減輕神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷，具有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用[5]。Trx與Trx還原酶(TrxR)及還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NADPH)組成硫氧還蛋白系統(tǒng)，發(fā)揮抗氧化功能，并參與調(diào)控戊四氮(pentylenetet-razol，PTZ)點(diǎn)燃致癲癇小鼠模型氧化應(yīng)激過程[6,7]。Trx-1是Trx蛋白家族中的主要成員，參與氧化還原反應(yīng)，并通過凋亡信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞凋亡[8]。本研究擬通過PTZ誘導(dǎo)大鼠癲癇模型，并采用Trx-1過表達(dá)慢病毒進(jìn)行干預(yù)，探討其對(duì)大鼠海馬組織神經(jīng)元損傷及細(xì)胞凋亡的影響，以期為癲癇的臨床治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 40只健康清潔級(jí)SD大鼠(長沙市天勤生物技術(shù)有限公司)，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(湘)2014-0010，體質(zhì)量230～250 g，7～8周齡。

1.1.2試劑 載體(上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司)；引物(南京金斯瑞生物科技有限公司)；TRIzol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連TaKaRa公司)；SYBR Green PCR試劑盒(美國KAPA Biosystems公司)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(北京康為世紀(jì)公司)；兔抗Trx-1多克隆抗體(美國CST公司，貨號(hào)：#2298)；兔抗B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)多克隆抗體、兔抗Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)多克隆抗體、兔抗磷酸化c-Jun末端激酶(phospho c-Jun N-terminal kinase，p-JNK)單克隆抗體、兔抗凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1(apoptosis signal regulating kinase-1，ASK1)多克隆抗體(美國Abcam公司，貨號(hào)：ab 196495、ab53154、ab124956、ab1315 06)；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(美國Promega公司)。

1.1.3儀器 ChemiDoc Touch系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.2方法

1.2.1Trx-1過表達(dá)重組慢病毒載體設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)Trx-1基因序列，設(shè)計(jì)合成含Trx-1和綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的慢病毒載體(ov-Trx-1-GFP)及陰性對(duì)照慢病毒載體(NC-GFP)，慢病毒載體滴度為5×108TU/ml。

1.2.2動(dòng)物分組及處理 40只SD大鼠隨機(jī)分為4組：對(duì)照組、模型組、Trx-1過表達(dá)組和陰性對(duì)照組，每組10只。大鼠腹腔注射0.5%戊巴比妥鈉溶液(40 mg/kg)，麻醉后固定于立體定位儀中，Trx-1過表達(dá)組大鼠兩側(cè)海馬區(qū)注射2.5 μl ov-Trx-1-GFP慢病毒溶液，陰性對(duì)照組大鼠于相同位置注射等量的NC-GFP慢病毒溶液，對(duì)照組和模型組注射等量生理鹽水。慢病毒轉(zhuǎn)染大鼠海馬區(qū)14 d后構(gòu)建PTZ點(diǎn)燃癲癇模型。

1.2.3建模 除對(duì)照組外，其他組大鼠腹腔反復(fù)注射PTZ(35 mg/kg)，對(duì)照組注射等量生理鹽水，1次/d。注射PTZ 1 h后觀察大鼠狀態(tài)及行為變化，記錄大鼠癲癇驚厥情況。根據(jù)Smialowki癲癇發(fā)作分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估大鼠癲癇驚厥級(jí)別，0級(jí)：無反應(yīng)；1級(jí)：面部運(yùn)動(dòng)，指鼻子、點(diǎn)頭、奔跑；2級(jí)：前肢痙攣；3級(jí)：前肢痙攣伴后退；4級(jí)：前肢痙攣伴后退及摔倒發(fā)作；5級(jí)：摔倒、強(qiáng)直發(fā)作[9]。連續(xù)注射3 d PTZ后，大鼠的癲癇發(fā)作級(jí)別均為4～5級(jí)則視為建模成功。模型建立成功后，大鼠麻醉斷頭取腦，分離海馬組織，一部分采用4%多聚甲醛固定，另一部分-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4RT-PCR檢測(cè)Trx-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量 TRIzol提取海馬組織總RNA，試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。Trx-1引物序列為：F：5′-TTCTTTCATTCCCTCTGTG-3′，R：5′-TCCGTAATAGTGGCTTCG-3′，內(nèi)參基因GAPDH引物序列：F：5′-CCACTCCTCCACCTTTG-3′，R：5′-CACCACCCTGTTGCTGT-3′。 2-ΔΔCt法計(jì)算。

1.2.5Western blot檢測(cè)蛋白相對(duì)表達(dá)量 提取各組海馬組織總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，蛋白上樣量為20 μl,轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。PBST洗膜后加入一抗稀釋液(1∶1 000)，室溫孵育1 h。PBST洗膜，加入二抗稀釋液，室溫孵育1 h。PBST洗膜，滴加化學(xué)發(fā)光試劑顯影，ChemiDoc Touch系統(tǒng)采集圖像，以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算其他蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6HE染色觀察海馬組織形態(tài) 取固定海馬組織，常規(guī)制片：組織脫水，浸蠟包埋，切成4 μm厚片，脫蠟至水。加入蘇木素染液染色3 min，流水沖洗后加入1%鹽酸乙醇分化1 min。流水沖洗，加入促藍(lán)液返藍(lán)1 min，洗滌后加入伊紅染液染色3 min。乙醇脫水，二甲苯通透，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.7TUNEL染色觀察海馬組織細(xì)胞凋亡 將海馬組織切片進(jìn)行脫蠟脫水處理，按照TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒說明書操作，顯微鏡下觀察海馬組織細(xì)胞凋亡情況，統(tǒng)計(jì)3個(gè)切片TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)，取平均值。

2 結(jié)果

2.1大鼠行為觀察 PTZ連續(xù)注射8 d后，模型組和陰性對(duì)照組大鼠出現(xiàn)1級(jí)驚厥發(fā)作，15 d后，Trx-1過表達(dá)組大鼠出現(xiàn)驚厥發(fā)作，20 d后，模型組和陰性對(duì)照組大鼠連續(xù)3 d均表現(xiàn)出4～5級(jí)癲癇驚厥行為，說明PTZ成功點(diǎn)燃癲癇模型，PTZ點(diǎn)燃成功后，對(duì)照組大鼠未出現(xiàn)驚厥發(fā)作，模型組與陰性對(duì)照組大鼠驚厥發(fā)作時(shí)間長、級(jí)別高，而Trx-1過表達(dá)組大鼠驚厥時(shí)間明顯縮短，級(jí)別明顯降低(P<0.01)。見表1。

表1 大鼠癲癇發(fā)作情況比較Tab.1 Comparison of epileptic seizures in

2.2Trx-1 mRNA及蛋白表達(dá)水平 與對(duì)照組相比，模型組大鼠海馬組織Trx-1表達(dá)顯著降低(P<0.01)，與模型組相比，Trx-1過表達(dá)組Trx-1表達(dá)顯著升高(P<0.01)，說明Trx-1過表達(dá)重組慢病毒載體轉(zhuǎn)染成功。見圖1。

圖1 Trx-1 mRNA及蛋白表達(dá)Fig.1 mRNA and protein expressions of Trx-1Note:Compared with control group,**.P<0.01;compared with model group,##.P<0.01.

2.3Trx-1過表達(dá)對(duì)大鼠海馬組織形態(tài)的影響 對(duì)照組細(xì)胞排列整齊緊密，細(xì)胞輪廓清晰，無明顯病變。模型組和陰性對(duì)照組細(xì)胞形狀不規(guī)則，排列疏松，細(xì)胞核固縮深染，細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)嚴(yán)重空泡化。與模型組相比，Trx-1過表達(dá)組海馬神經(jīng)元損傷減輕，細(xì)胞輪廓較清晰，排列整齊，細(xì)胞質(zhì)空泡化程度降低。見圖2。

圖2 HE染色觀察海馬組織形態(tài)(×200)Fig.2 Hippocampus morphology observed by HE staining(×200)

2.4Trx-1過表達(dá)對(duì)大鼠海馬組織細(xì)胞凋亡的影響 TUNEL染色觀察各組海馬組織細(xì)胞凋亡水平，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組和陰性對(duì)照組凋亡細(xì)胞數(shù)顯著增加(P<0.01)，與模型組相比，Trx-1過表達(dá)組細(xì)胞凋亡數(shù)顯著減少(P<0.01)。見圖3。

圖3 各組海馬組織凋亡細(xì)胞數(shù)比較Fig.3 Comparison of apoptotic cells in hippocampus of each groupNote:Compared with control group,**.P<0.01;compared with model group,##.P<0.01.

2.5Trx-1過表達(dá)對(duì)大鼠海馬組織凋亡相關(guān)蛋白的影響 與對(duì)照組相比，模型組Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01)，而Bax、ASK1和p-JNK蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，Trx-1過表達(dá)組Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)，而Bax、ASK1和p-JNK蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01)。見圖4。

圖4 Trx-1過表達(dá)對(duì)Bcl-2、Bax、ASK1和p-JNK蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of Trx-1 overexpression on proteins expressions of Bcl-2,Bax,ASK1 and p-JNKNote:Compared with control group,**.P<0.01;compared with model group,##.P<0.01.

3 討論

癲癇是一種復(fù)雜的神經(jīng)綜合征，具有刻板性、發(fā)作性和反復(fù)性等特點(diǎn)，全球90%以上的癲癇發(fā)生于中低收入水平國家，且伴有認(rèn)知、心理及生理學(xué)等方面的并發(fā)癥[10,11]。癲癇主要由多種因素導(dǎo)致大腦神經(jīng)元過度興奮和突然的同步放電引發(fā)，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜[12]?？拱d癇藥物治療效果不理想，對(duì)癲癇發(fā)病機(jī)制及新型治療方法的研究對(duì)改善癲癇治療現(xiàn)狀具有重要意義。

ASK1在生物體內(nèi)具有重要的生理功能，特別是在應(yīng)激條件下，對(duì)氧化應(yīng)激高度敏感，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，可被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、氧化應(yīng)激及炎癥信號(hào)等激活，過度活化后的ASK1可激活下游JNK通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，引起組織形態(tài)學(xué)改變及多種應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而引發(fā)多種疾病[13,14]。JNK是絲裂原活化蛋白激酶家族主要成員，JNK信號(hào)傳導(dǎo)可參與外源性凋亡途徑及線粒體引發(fā)的內(nèi)源性凋亡途徑，是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子，抑制腫瘤發(fā)展[14,15]。研究顯示多種磷酸化信號(hào)通路與遺傳因素和后天性腦損傷引起的癲癇發(fā)病機(jī)制相關(guān)，在癲癇動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)JNK存在過度激活，推測(cè)JNK介導(dǎo)的磷酸化信號(hào)可能是一種新的抗癲癇治療靶點(diǎn)[16]。Trx作為ASK1信號(hào)的調(diào)控成分之一，可通過調(diào)節(jié)ASK1/JNK信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞凋亡[13]。研究發(fā)現(xiàn)，Trx-1/Trxr-1系統(tǒng)參與胸腺細(xì)胞內(nèi)ASK1及JNK磷酸化過程，上調(diào)該系統(tǒng)表達(dá)水平及控制細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)穩(wěn)定對(duì)胸腺細(xì)胞的存活至關(guān)重要[17]。Wong等[18]研究結(jié)果也證實(shí)了Trx-1是一種內(nèi)源性抗凋亡分子，可通過抑制ASK1-JNK/p38信號(hào)通路減少神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，減輕腦缺血再灌注損傷。

PTZ是一種中樞系統(tǒng)興奮劑，在神經(jīng)元完好的情況下，反復(fù)注射PTZ可誘導(dǎo)慢性癲癇動(dòng)物模型[18]。本研究采用PTZ誘導(dǎo)大鼠癲癇模型，模型組大鼠癲癇發(fā)作時(shí)間長、級(jí)別高，海馬組織出現(xiàn)嚴(yán)重?fù)p傷，細(xì)胞凋亡增加，經(jīng)過Trx-1過表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染干預(yù)后，癲癇大鼠的癲癇驚厥發(fā)作時(shí)間縮短，級(jí)別降低，海馬組織損傷減弱，且細(xì)胞凋亡數(shù)量減少，抗凋亡基因Bcl-2表達(dá)上調(diào)，而促凋亡基因Bax、ASK1及p-JNK表達(dá)下調(diào)。綜上，過表達(dá)Trx-1對(duì)癲癇具有較好的治療作用，可減緩海馬組織損傷及細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與下調(diào)ASK1/JNK信號(hào)通路有關(guān)。