孟祥雪 宋 冰 葉盛開

(中國人民解放軍第967醫(yī)院，錦州醫(yī)科大學研究生培養(yǎng)基地，大連 116021)

隨著糖尿病發(fā)病率升高，超重和肥胖比率逐年提高[1]。肥胖的發(fā)生是由于能量代謝失衡，導致脂肪代謝紊亂[2]。骨骼肌是機體最大的能量代謝器官，腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-actived protein kinaseα，AMPKα)是機體細胞的能量感受器，在脂肪酸代謝調節(jié)，產熱和脂肪組織發(fā)育中起關鍵作用[3-6]。

Toll樣受體(toll-like receptors，TLRs)作為模式識別受體不僅在感染免疫和損傷誘導的炎癥反應中發(fā)揮重要作用，還參與代謝相關疾病的發(fā)生發(fā)展，是目前研究中與肥胖關系最為密切的模式識別受體[7]。研究表明，高脂飲食時游離脂肪酸和脂多糖促進巨噬細胞、脂肪細胞和骨骼肌細胞表達TLR4及相關炎癥信號分子(MyD88、p-NF-κB p65)[8-10]。但尚無文章提到TLR4通過AMPKα對小鼠骨骼肌脂代謝產生影響，故本文將TLR4與AMPKα聯(lián)系起來進行探討。

AMPK是對能量變化和能量轉換極其敏感的一種激酶，廣泛存在于骨骼肌、肝臟、胰腺和脂肪組織。AMPK以異源三聚體復合物形式存在，由α、β和γ 3個亞基組成，其中α亞基是催化亞基，具有α1和α2 2個亞型，α1主要表達于心臟、腦、肝臟等組織，α2主要在骨骼肌、心臟和肝臟中表達，對AMPKα活性起主要作用[11]。α2亞基比α1亞基對AMP的敏感性更高，是α1亞基活性的4倍[12]。骨骼肌AMPKα的激活依賴于α2亞基Thr172磷酸化。AMPKα在正常生理或病理過程中均發(fā)揮重要作用，在正常的細胞應激反應中，當機體發(fā)生能量危機時，ATP濃度下降，AMP濃度上升，細胞內AMP/ATP比例升高，此時，AMPKα被激活，在代謝綜合征等病理狀態(tài)下，伴隨能量代謝紊亂，AMPKα活性被抑制[13]。通常以p-AMPKα蛋白表達量表示AMPKα的激活程度，以p-AMPKα/AMPKα表示[14]。

AMPK的主要功能是通過乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase,ACC)的磷酸化來調節(jié)脂質代謝[15]。ACC是近年來在肥胖機制研究中被逐漸重視的一種促進脂肪酸合成的限速酶，有ACC1和ACC2 2種同工型[16]。在肌肉、心肌等部位，AMPK主要通過抑制ACC2和增強內堿脂酰轉移酶(carnitine palmitoyltransfer enzyme-1,CPT-1)的活性減少脂肪酸合成并促進脂肪酸氧化[17]。激活的AMPK可使ACC磷酸化而失活，導致丙二酸單酰輔酶A活性降低，減輕對CPT-1的變構抑制，從而增強CPT-1活性，CPT-1可將長鏈脂肪酸從肉堿運送到線粒體進行β-氧化。CPT-1位于線粒體外膜，有CPT-1A(肝臟型)、CPT-1B(肌肉型)、CPT-1C(腦型)3種同工型，其表達上升可促進脂肪酸分解，降低機體脂肪酸含量。因此假設TLR4基因可能調節(jié)肥胖小鼠骨骼肌AMPK-ACC活性，改善脂代謝紊亂。本實驗采用TLR4基因敲除的C57BL/6J小鼠，給予高脂飲食誘導肥胖，觀察其骨骼肌組織脂代謝指標的變化。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 SPF級4周齡C57BL/6J雄性小鼠24只(北京華阜康生物科技有限公司)和TLR4基因敲除小鼠24只(美國Jackson實驗室)雜交，喂養(yǎng)于錦州醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.1.2試劑 BCA蛋白定量試劑盒、RIPA裂解液、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、一抗二抗去除液、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、超敏ECL化學發(fā)光液、DAB顯色液、HE染色試劑盒、MyD88兔多克隆抗體、p-NF-κB p65兔多克隆抗體、AMPKα兔多克隆抗體、兔抗鼠β-actin內參一抗、辣根酶標記山羊抗兔IgG抗體(沈陽萬類公司)；免疫組化染色試劑盒(北京博奧森公司)；TLR4兔多克隆抗體、p-AMPKα(Thr172)兔多克隆抗體、p-ACC(Ser80)兔多克隆抗體(美國Affinity)；ACC兔多克隆抗體(美國CST)；CPT-1B兔多克隆抗體(武漢博士德公司)；小分子Maker(26616#)和大分子Maker(26619#)(上海賽默飛公司)。

1.2方法

1.2.1動物分組與處理 小鼠隨機分為正常對照組(NC，8只)、肥胖組(OB，16只)、TLR4 基因敲除組(TK，8只)和TLR4基因敲除肥胖組(TO，16只)。自由飲水、攝食，動物房內12 h 晝夜循環(huán)，(22±2)℃。專用高能量飼料(含脂肪60%)喂養(yǎng)OB組和TO組小鼠，小鼠全價營養(yǎng)顆粒基礎飼料(含脂肪10%)喂養(yǎng)NC組和TK組小鼠，16周后OB組小鼠體質量大于NC組小鼠上限且不發(fā)生糖尿病，TO組小鼠體質量大于TK組小鼠上限且不發(fā)生糖尿病。隨機各選取8只用于后續(xù)實驗。所有實驗程序均符合錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院倫理委員會規(guī)定。

1.2.2生化指標檢測 每周禁食不禁水8 h，斷尾檢測空腹血糖(fasting plasma glucose,FPG)水平，測體質量。16周后，禁食8 h，斷頭取血，測定FPG、TG、TC、LDL-C、HDL-C和FFA水平。處死前1周進行糖耐量試驗(intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT，2 g/kg)。Western blot檢測：小鼠處死后，取左側腓腸肌組織，-80℃保存。取少量小鼠腓腸肌組織剪碎后加入RIPA裂解液(1∶100)，靜置10 min，超聲3次，10 s/次，12 000 r/min離心20 min(4℃)，取中層液體，BCA蛋白定量試劑盒測定總濃度，調整各蛋白濃度至2 mg/ml，95℃水浴5 min，-20℃保存?zhèn)溆谩２捎梅蛛x膠(8%和10%)、濃縮膠(5%)電泳，10 μl/孔樣本及4 μl/孔Marker上樣，1×上樣緩沖液防止邊緣效應，蛋白濕轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉 3 h，加入一抗4℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗室溫孵育1 h。GISt020凝膠圖像分析儀成像，ImageJ軟件分析條帶灰度值。

1.2.3HE染色 分離組織，以10%福爾馬林溶液固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟至水，蘇木素染色(2 min)，自來水沖洗10 min，蒸餾水沖洗1 min，1%鹽酸酒精分化3 s，自來水沖洗1 min，1%伊紅染液染色1 min，蒸餾水洗1 min，脫水，透明，封片，光學顯微鏡下觀察。

1.2.4免疫組織化學染色 分離組織，以10%福爾馬林溶液固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟至水，抗原修復，3%過氧化氫孵育，山羊血清封閉，加入一抗、二抗孵育，辣根酶標記，DAB顯色，蘇木素復染，顯微鏡下觀察并拍照，每個標本隨機選取3張切片，每張切片選取5個視野，Image Pro Plus 6.0軟件計算p-AMPKα、p-ACC、CPT-1B表達。

2 結果

2.1敲除TLR4基因對高脂飲食誘導的肥胖小鼠體質量及血脂代謝的影響 與NC組相比，OB組小鼠體質量、FPG、FFA、TG、TC、LDL-C水平升高，HDL-C水平降低；與OB組相比，TO組小鼠體質量、FPG、FFA、TG、TC、LDL-C水平均降低，HDL-C水平升高；與TO組相比，TK組小鼠體質量、FPG、TC、TG、LDL-C水平降低，HDL-C水平上升，F(xiàn)FA水平降低(表1)。

表1 各組小鼠體質量及生化指標Tab.1 Body weight and biochemical indicators of each

2.2TLR4基因敲除減輕高脂飲食誘導的肥胖小鼠骨骼肌炎癥細胞浸潤程度 HE染色結果顯示，NC組與TK組小鼠腓腸肌排列均勻，橫紋清晰；OB組小鼠腓腸肌有大量炎癥細胞浸潤；TK組小鼠骨骼肌排列均勻，橫紋清晰，炎癥細胞浸潤減輕，TO組小鼠骨骼肌炎癥細胞浸潤明顯減輕(圖1)。

圖1 各組小鼠骨骼肌組織HE染色(×400)Fig.1 HE staining of skeletal muscle tissues of mice in each group(×400)

2.3TLR4基因敲除上調高脂飲食誘導的肥胖小鼠骨骼肌組織p-AMPKα、p-ACC 和CPT-1B表達 免疫組化染色結果顯示，與NC組相比，OB組小鼠骨骼肌組織p-AMPKα、p-ACC、CPT-1B表達下降；與OB組相比，TO組小鼠骨骼肌組織p-AMPK、p-ACC、CPT-1B表達上升，與TK相比，TO組小鼠骨骼肌組織p-AMPKα、p-ACC、CPT-1B表達上升(圖2)。

圖2 免疫組化檢測各組小鼠骨骼肌組織p-AMPKα、p-ACC、CPT-1B表達(×400)Fig.2 Expressions of p-AMPKα，p-ACC and CPT-1B in mice skeletal tissue were detected by IHC staining in each group(×400)Note:Compared with NC,**.P<0.01；compared with TK,##.P<0.01;compared with OB,△△.P<0.01.

2.4TLR4基因敲除上調高脂飲食誘導的肥胖小鼠骨骼肌組織AMPK蛋白活性 與NC組相比，OB組小鼠骨骼肌組織TLR4、MyD88、NF-κB p65、ACC表達上升，AMPKα、p-AMPKα、p-ACC、CPT-1B表達下降；與OB組相比，TO組小鼠骨骼肌組織TLR4、MyD88、p-NF-κB p65、ACC表達降低，AMPKα、p-AMPKα、p-ACC、CPT-1B表達上升;與TK組相比，TO組小鼠骨骼肌組織TLR4、MyD88、p-NF-κB p65、ACC表達上升，AMPKα、p-AMPKα、p-ACC、CPT-1B表達降低(圖3)。

圖3 各組小鼠骨骼肌組織TLR4、MyD88、p-NF-κB p65、p-AMPK、AMPK、p-ACC、ACC、CPT-1B蛋白表達Fig.3 TLR4，MyD88，p-NF-κB p65，p-AMPK，AMPK，p-ACC，ACC，CPT-1B protein expressions in skeletal muscle tissue of miceNote:Compared with NC,*.P<0.05，**.P<0.01；compared with TK,#.P<0.05，##.P<0.01;compared with OB,△.P<0.05,△△.P<0.01.

2.5AMPK活性與血糖、血脂的相關性分析 AMPK活性與FPG、FFA、TG、TC、LDL-C呈負相關(r=-0.716、-0.612、-0.668、-0.542、-0.817，P<0.01)，與HDL-C呈正相關(r=0.630，P<0.01)。

3 討論

骨骼肌是機體代謝最為旺盛的組織之一，骨骼肌代謝異常不僅會引起肌無力、肌萎縮等肌肉自身病變且會對全身造成不良影響，引發(fā)肥胖、糖尿病等多種代謝性疾病，嚴重降低人們的生活質量。肥胖發(fā)病率逐年上升，使其成為亟待解決的問題[18-20]。經過高脂飼料誘導后，若OB組小鼠體質量及血清TC、TG、LDL-C水平明顯升高，提示造模成功[21]。

有研究表明TLR4抑制劑可抑制基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP9)分泌，與非脂多糖處理組相比，脂多糖刺激使MMP9水平提高1.79倍，細胞內MMP9直接或間接導致AMPKα降解[22，23]。本研究中，與NC組相比，OB組小鼠TLR4表達上升，AMPK表達下降，與既往研究結論一致。

AMPK是調節(jié)機體脂質代謝的“壓力計”，能增強胰島素敏感性、減少肝糖輸出，且能通過AMPK磷酸化抑制脂肪酸合成，增強線粒體對脂肪酸的利用及氧化[24，25]。激活的AMPK可使ACC磷酸化而失活[26]。 ACC通過催化乙酰輔酶A生成丙二酸單酰輔酶A，在脂肪酸代謝過程中發(fā)揮重要作用，而抑制ACC活性可抑制脂質合成[27]。Liu等[28]研究發(fā)現(xiàn)，ACC-β基因敲除小鼠的采食量升高，但是體內的脂肪含量降低，表明ACC-β基因敲除后脂肪酸氧化速率加快，進而導致體內脂肪囤積減少。本研究中，與NC組相比，OB組小鼠AMPK、p-AMPK、p-ACC、CPT1B表達下降，ACC表達上升，與既往研究結論一致。

CPT-1在介導?；M入線粒體的過程中發(fā)揮重要作用，是線粒體β氧化的關鍵酶，其表達水平升高促進脂肪酸分解，降低機體脂肪含量[28]。本研究中，與OB組相比，TO組小鼠骨骼肌CPT-1B表達上升，F(xiàn)FA、TG、TC、LDL-C水平降低，HDL-C水平升高。

目前針對通過各種運動、電針等改善肥胖小鼠骨骼肌能量代謝的報道較多，但TLR4基因敲除對骨骼肌能量代謝影響的報道較少，因此本研究采用高脂飲食誘導肥胖小鼠，對比肥胖小鼠與TLR4基因敲除組肥胖小鼠骨骼肌AMPK-ACC-CPT1B表達，初步認為TLR4基因敲除可通過激活肥胖小鼠骨骼肌組織AMPKα、ACC磷酸化而失活，CPT-1B表達上升，減少脂肪酸合成，增強脂肪酸β-氧化，從而降低血清FFA、TC、TG、LDL水平，提高血清HDL水平，但TLR4對骨骼肌能量代謝及血脂的影響是否還有其他信號通路有待進一步研究。

致謝:感謝2016年遼寧省自然科學基金(201602308)的資金支持以及遼寧省腦與脊髓損傷重點實驗室鄭華川和翟振華老師提供的實驗材料和實驗設備支持。