李 靜 隋汝波

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，錦州 121000)

腦是人體對缺氧最為敏感的器官，腦組織缺血將會導(dǎo)致腦組織損傷及功能障礙，及時恢復(fù)腦部血供有利于減輕損傷。然而腦缺血一定時間后再恢復(fù)血液灌注，會加重腦組織結(jié)構(gòu)及功能的損傷，稱為缺血再灌注(ischemia-reperfusion，IR)損傷[1]。腦IR涉及多種發(fā)病機制，包括氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、細胞自噬、細胞凋亡、炎癥反應(yīng)的啟動等[2-5]。針對其各種發(fā)病機制的治療研究在近幾年已成為熱點，但其理想的有效治療措施仍有待進一步探索。

山竹，又稱鳳果，是藤黃科藤黃屬常綠喬木山竹的果實。α-倒捻子素作為山竹果殼的提取物之一，具有明顯的抗炎、抗氧化、抗腫瘤和抗菌作用[6,7]。研究表明，α-倒捻子素對骨髓來源的肥大細胞中COX-2 mRNA的表達有一定的下調(diào)作用[8]。α-倒捻子素能降低磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)的活性，抑制蛋白激酶Akt的磷酸化，影響NF-κB信號通路[9]。Yao等[10]發(fā)現(xiàn)，在阿爾茨海默癥小鼠模型的腦組織中，α-倒捻子素可明顯降低炎癥引起的小膠質(zhì)細胞的激活。Pedraza-chaverrí等[11]發(fā)現(xiàn)，α-倒捻子素濃度依賴性減少由3-硝基丙酸誘導(dǎo)的神經(jīng)細胞死亡，并推測這個過程可能與ROS的減少有關(guān)。目前關(guān)于α-倒捻子素在腦IR損傷中的作用及其機制的研究卻鮮有報道。本實驗通過建立大鼠腦IR損傷模型，并分別設(shè)立5組實驗，觀察并分析α-倒捻子素對大鼠腦IR損傷的保護作用及機制，以期為腦IR損傷的有效治療探索新的方法。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 清潔級SD雄性大鼠230～250 g 100只，購于上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，所有動物實驗均經(jīng)倫理委員會批準。

1.1.2主要試劑 二甲基亞砜(DMSO)購自Gibco公司；α-倒捻子素(純度≥98%)購自北京友誼眾生生物科技有限公司，使用時用DMSO稀釋至目標濃度；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；ELISA試劑盒購自PeproTech公司；胰酶購自Hyclone公司；BCA蛋白定量試劑盒購自Biovision公司；兔抗MAP2抗體、抗NF-κB抗體、抗CyclinD1抗體、抗c-Myc抗體、抗Bcl-2抗體、抗Bax抗體、抗Caspase-3抗體、抗GAPDH抗體均購自Abcam公司；辣根過氧化物酶標記的驢抗兔抗體購自中杉金橋公司。

1.1.3儀器 紫外分光光度計為Mettler Toledo公司產(chǎn)品；超速離心機、低溫離心機為Thermo Fisher公司產(chǎn)品；Mini Protean 3 cell電泳儀、離心機為Bio-Rad公司產(chǎn)品；酶標儀為美國Molecular Derices公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1腦IR損傷模型的建立 所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，術(shù)前12 h禁食，用3%戊巴比妥(65 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠后，仰臥位固定于手術(shù)臺上，頸部剪毛消毒，取頸部正中做一切口，鈍性分離周圍組織并暴露雙側(cè)頸總動脈，利用微血管夾夾閉雙側(cè)頸總動脈，夾閉40 min后，撤去血管夾，實現(xiàn)大腦中動脈再灌注，腦IR模型建立完成。

1.2.2實驗分組 所有大鼠隨機分成5組，每組20只。假手術(shù)組(Sham)：僅暴露雙側(cè)頸總動脈而不夾閉，術(shù)后灌胃給予等量DMSO；模型組(IR)：按上述方法建立腦IR損傷模型，術(shù)后灌胃給予等量DMSO；α-倒捻子素低劑量組(α-M-L 5 mg/kg)，α-倒捻子素中劑量組(α-M-M group 10 mg/kg)，α-倒捻子素高劑量組(α-M-H group 20 mg/kg)。每組大鼠均給藥至術(shù)后14 d。

1.2.3神經(jīng)行為學(xué)評分 各組大鼠于術(shù)后14 d進行Bederson′s評分：行為都正常記0分；提鼠尾離地約30 cm，手術(shù)對側(cè)前肢內(nèi)旋、內(nèi)收記1分；推大鼠雙肩，手術(shù)對側(cè)抗力下降記2分；觀察大鼠在水平面行走情況，圍繞健側(cè)轉(zhuǎn)圈記3分；不能自主活動記4分。分數(shù)越高說明神經(jīng)損傷越嚴重。

1.2.4腦組織存活神經(jīng)元檢測 術(shù)后14 d每組隨機取6只大鼠處死，4%多聚甲醛灌注，再斷頭取腦并將腦組織浸于4%多聚甲醛中固定過夜，梯度蔗糖脫水過夜，再用OCT包埋劑包埋腦組織，-20℃冰凍30 min后，于冠狀面將腦組織自前往后間隔2 mm切取6張連續(xù)的腦組織切片，再將腦組織切片放入5%牛血清白蛋白(BSA)和0.1% Triton X-100中室溫孵育1 h。在一抗(MAP2，1∶500)中4℃孵育過夜，PBS清洗3次，每次5 min。再在二抗(Alexa Fluor 488，1∶500)中室溫孵育1 h，PBS清洗后，細胞核用DAPI染色(1∶1 000)，于熒光顯微鏡下觀察，應(yīng)用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件處理并作統(tǒng)計,計算每組大鼠腦組織切片中存活神經(jīng)元的數(shù)量。

1.2.5腦組織氧化因子檢測 術(shù)后14 d，取各組大鼠大腦皮層組織，制成10%的腦勻漿液。3 000 r/min離心10 min，取上清液并按各個試劑盒說明書中的操作說明檢測腦組織SOD活性及MDA含量。

1.2.6ELISA檢測腦組織中炎癥因子含量 術(shù)后14 d，取各組大鼠大腦皮層組織，制成10%的腦勻漿液，3 000 r/min 4℃下離心10 min，收集上清液，ELISA試劑盒檢測上清液中IL-1β、IL-6和腫瘤壞死因子(TNF)-α含量。使用酶標儀在450 nm下測定OD值。每組實驗重復(fù)3次。

1.2.7Western blot檢測腦組織中NF-κB信號通路相關(guān)蛋白及凋亡相關(guān)蛋白的表達 術(shù)后14 d，取各組大鼠大腦皮層組織，用冰的細胞裂解液充分裂解，10 000 r/min離心10 min，取上清進行BCA蛋白定量。取蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳和電轉(zhuǎn)膜，90 V恒壓模式電泳，220 mA電轉(zhuǎn)90 min，5%脫脂奶粉封閉1 h后，使用抗磷酸化NF-κB(p-NF-κB)抗體(1∶1 000)、抗CyclinD1抗體(1∶1 000)、抗c-Myc抗體(1∶800)、抗GAPDH抗體(1∶5 000)4℃孵育過夜。PBS-Tween20液漂洗，HRP標記的二抗反應(yīng)，再次用PBS-Tween20液洗膜，ECL顯色，凝膠成像儀中曝光和拍照，檢測腦組織中NF-κB信號通路相關(guān)蛋白的表達。按照上述方法檢測凋亡基因蛋白Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9的表達?；叶戎涤肐mage Pro Plus 6.0軟件測定。每組實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分及腦組織神經(jīng)元存活情況比較 除假手術(shù)組外，其余各組均表現(xiàn)出神經(jīng)行為學(xué)損傷(P<0.05)，其中，模型組神經(jīng)行為學(xué)評分最高(P<0.05)，α-倒捻子素高劑量組神經(jīng)行為學(xué)評分明顯低于α-倒捻子素低、中劑量組(P<0.05)。模型組腦組織存活的神經(jīng)元數(shù)量最少且明顯少于其余各組(P<0.05)；α-倒捻子素高劑量組腦組織存活的神經(jīng)元數(shù)量明顯多于α-倒捻子素低、中劑量組(P<0.05)，α-倒捻子素低劑量組與α-倒捻子素中劑量組的腦組織存活的神經(jīng)元數(shù)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1、表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分及神經(jīng)元存活情況Tab.1 Neurobehavioral scores and neuronal survivals in each

圖1 各組大鼠腦組織神經(jīng)元存活情況Fig.1 Neuronal survivals of brain tissues in each groupNote:Blue for DAPI,green for MAP2.

2.2各組大鼠腦組織中SOD活性及MDA含量的比較 與假手術(shù)組相比，其余各組SOD活性均降低(P<0.05)，其中，模型組SOD活性明顯低于α-倒捻子素低、中、高劑量組(P<0.05)，α-倒捻子素高劑量組SOD活性明顯高于α-倒捻子素低、中劑量組(P<0.05)。與假手術(shù)組相比，其余各組MDA含量均升高(P<0.05)，其中，模型組MDA含量最高(P<0.05)，α-倒捻子素低、中、高劑量組間MDA含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠腦組織中SOD活性及MDA含量Tab.2 Activities of SOD and contents of MDA of brain tissues in each

2.3各組大鼠腦組織細胞中炎癥因子含量的比較 與假手術(shù)組相比， 其余各組的炎癥因子水平均升高(P<0.05)，其中，模型組3種炎癥因子的水平明顯高于α-倒捻子素低、中、高劑量組(P<0.05)；α-倒捻子素高劑量組IL-1β、IL-6的水平明顯低于α-倒捻子素低、中劑量組(P<0.05)；α-倒捻子素中、高劑量組TNF-α的水平明顯低于α-倒捻子素低劑量組(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠腦組織細胞中炎癥因子含量Tab.3 Contents of inflammatory cytokines of brain tissuesin each

2.4各組大鼠腦組織中NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達量的比較 模型組3種NF-κB信號通路相關(guān)蛋白的表達量最高且明顯高于其余組(P<0.05)，α-倒捻子素低、中、高劑量組p-NF-κB蛋白的表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；α-倒捻子素高劑量組CyclinD1、c-Myc蛋白的表達量明顯低于α-倒捻子素低、中劑量組(P<0.05)。見圖2、表4。

表4 各組大鼠腦組織細胞NF-κB信號通路相關(guān)蛋白的相對表達量Tab.4 Relative expressions of NF-κB signaling pathway-related proteins in each

圖2 Western blot檢測NF-κB信號通路相關(guān)蛋白的表達Fig.2 Western blot was used to detect expressions of NF-κB signaling pathway-related proteins

2.5各組大鼠腦組織中凋亡相關(guān)蛋白表達量的比較 模型組Bax、Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9的表達量最高且明顯高于其余組(P<0.05)，Bcl-2的表達量最低且明顯低于其余組(P<0.05)；α-倒捻子素高劑量組Bcl-2的表達量明顯高于α-倒捻子素低、中劑量組(P<0.05)；α-倒捻子素低、中、高劑量組間Bax，Cleaved caspase-3，Cleaved caspase-9的表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，與假手術(shù)組相比均有明顯差異(P<0.05)。見圖3、表5。

圖3 Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達Fig.3 Western blot was used to detect expressions of apoptosis-related proteins

表5 各組大鼠腦組織細胞凋亡相關(guān)蛋白的相對表達量Tab.5 Relative expressions of apoptosis-related proteins in each

3 討論

急性缺血性腦卒中發(fā)生時腦血流的中斷可引起能量的大量消耗甚至導(dǎo)致神經(jīng)元的死亡，當缺血腦組織再次血流灌注后，可導(dǎo)致再灌注損傷，涉及一系列病理生理過程[12]。腦IR損傷后，所產(chǎn)生的氧化應(yīng)激反應(yīng)會通過活性氧的直接損傷和間接損傷兩種方式損傷神經(jīng)元[13，14]。其中，活性氧可通過胞膜中脂質(zhì)過氧化、酶被氧化失活、堿基被修飾等，直接導(dǎo)致細胞損傷[15，16]。還可通過激活線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑、改變NF-κB信號通路通等間接造成神經(jīng)細胞損傷或凋亡[17，18]。α-倒捻子素作為一種植物提取物，可通過抗炎、抗氧化等作用保護組織細胞[9]。研究發(fā)現(xiàn)，α-倒捻子素可通過抑制TLR4/NF-κB信號通路緩解LPS誘導(dǎo)的細胞炎癥[19]。史繼德等[20]的研究表明了α-倒捻子素能夠抑制炎癥反應(yīng)，抑制骨關(guān)節(jié)炎細胞的凋亡。

本次研究首先按照標準的方法建立了腦IR損傷模型，保證了實驗干預(yù)因素的一致性，神經(jīng)行為學(xué)評分可從功能角度反映腦IR損傷程度，結(jié)果表明α-倒捻子素可明顯減輕腦IR損傷后神經(jīng)行為學(xué)損傷程度，并且在本次實驗中高劑量的α-倒捻子素表現(xiàn)出更好的療效。腦IR損傷引起腦組織功能障礙的主要原因之一是損傷可引起大量神經(jīng)元凋亡[21]。因此本研究對各組大鼠的腦組織進行了組織學(xué)觀察，結(jié)果提示腦IR損傷大鼠腦組織的神經(jīng)元會大量凋亡，而α-倒捻子素可有效促進神經(jīng)元的存活，對神經(jīng)元發(fā)揮保護作用。SOD廣泛存在于人體，是腦組織中清除自由基的有效成分[22]。MDA是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，可間接反映氧自由基的生成量和細胞損傷的程度[23]。進一步檢測各組大鼠腦組織中SOD活性及MDA含量，結(jié)果表明α-倒捻子素可增強腦IR損傷后大鼠腦組織中SOD活性，同時降低MDA的水平，從而有效減輕氧自由基的破壞作用，保護腦神經(jīng)細胞。

研究表明，腦IR損傷后，大量的活性氧自由基的產(chǎn)生還可進一步引發(fā)炎癥反應(yīng)，破壞血管壁，損傷血腦屏障，引起腦組織的繼發(fā)性損傷[24]。本實驗檢測了各組大鼠腦組織細胞中炎癥因子的水平，發(fā)現(xiàn)腦IR后可誘導(dǎo)腦組織中炎癥因子的大量釋放，而經(jīng)過α-倒捻子素治療后，炎癥因子的水平會大幅下降，并且α-倒捻子素劑量越高，炎癥因子水平越低，說明α-倒捻子素能有效抑制腦IR損傷引起的炎癥反應(yīng)。Franceschelli等[9]的研究表明α-倒捻子素能降低磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)的活性，抑制蛋白激酶Akt的磷酸化，影響NF-κB信號通路的研究結(jié)論。如上述，本研究已明確α-倒捻子素可對大鼠腦IR損傷起到保護作用，為進一步探索α-倒捻子素在發(fā)揮保護作用過程中的具體機制，對各組大鼠腦組織中NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達量進行了測定，結(jié)果提示了α-倒捻子素能有效抑制NF-κB信號通路的激活，并且α-倒捻子素的劑量越高，NF-κB信號通路相關(guān)蛋白的表達量越低，對NF-κB信號通路激活的抑制進而發(fā)揮了抗炎作用。為探究α-倒捻子素是否抑制了細胞凋亡效應(yīng)及其可能的機制，檢測了各組大鼠腦組織中凋亡相關(guān)蛋白的表達情況。Bcl-2基因是一種癌基因，具有抑制凋亡的作用，Bcl-2的過度表達能增強所觀察細胞對大多數(shù)細胞毒素的抵抗性[25]。Bax、Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9是3種與細胞凋亡密切相關(guān)的基因，其表達水平的升高會誘導(dǎo)細胞趨向于凋亡甚至加快細胞凋亡[26]。研究發(fā)現(xiàn)Bcl-2的表達升高與Bax、Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9表達升高分別與線粒體相關(guān)的凋亡信號通路的抑制和激活相關(guān)[27]。本研究結(jié)果表明α-倒捻子素在降低炎癥水平、促進神經(jīng)元存活同時抑制了細胞凋亡效應(yīng)并且其抑制凋亡效應(yīng)可能與線粒體凋亡信號通路的失活有關(guān)。

綜上所述，α-倒捻子素對大鼠腦IR損傷具有保護作用，其作用機制可能與抗氧化、降低損傷后炎癥反應(yīng)、抑制NF-κB信號通路的激活、抑制線粒體凋亡信號通路介導(dǎo)的細胞凋亡效應(yīng)有關(guān)。