王 澤，郗玲玲，齊劍英，梁新月，楊剛剛,3

(1.河南師范大學(xué) a.生命科學(xué)學(xué)院;b.河南省-科技部共建細(xì)胞分化調(diào)控國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，河南 新鄉(xiāng) 453007；2.上海大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200444；3.河南省功能性蛋白應(yīng)用工程技術(shù)研究中心，河南 新鄉(xiāng) 453007)

0 引言

豹蛙抗瘤酶(onconase,ONC)是當(dāng)前全球重點(diǎn)研究的100種新藥之一，已有研究表明：作為新型抗腫瘤和抗病毒藥物，ONC特異性降解轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸(transfer ribonucleic acid,tRNA)的作用機(jī)制，能夠有效殺傷多種實(shí)體腫瘤[1]，其抗病毒活性大于現(xiàn)有98%的抗病毒化合物[2]。ONC可選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞，且對(duì)正常細(xì)胞基本無影響[3-4]，具有特異性強(qiáng)、免疫原性低和不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，目前已在歐洲作為“孤兒藥”上市。

維生素C(Vitamin C,VC)是一種水溶性維生素，具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)和預(yù)防感冒等多種功能。VC具有價(jià)格低廉和大劑量使用無毒等優(yōu)點(diǎn)，并被證實(shí)在癌癥的預(yù)防與治療，以及減輕化療不良反應(yīng)方面具有明顯的效果，是近年來抗癌藥物研究的熱點(diǎn)[5-8]。

目前，ONC和VC的聯(lián)合作用尚未見報(bào)道，為增加ONC的腫瘤殺傷效果，減少不良反應(yīng)，同時(shí)充分利用 VC的優(yōu)點(diǎn)和良好的抗腫瘤特性，本文以大鼠肝癌RH-35細(xì)胞為研究對(duì)象，研究兩種藥物的單獨(dú)與聯(lián)合作用，評(píng)估兩者聯(lián)合作用的效果，為后期的腫瘤藥物聯(lián)合開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 試驗(yàn)

重組ONC由本實(shí)驗(yàn)室純化制備，純度高于95%[9]；VC粉末由河南新鄉(xiāng)華星藥廠提供；大鼠肝癌RH-35細(xì)胞來源于中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫；伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco’s modified Eagle medium,DMEM)和胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購于Gibico公司；磺酰羅丹明B(sulforhodamine B，SRB)購于Sigma公司；Hoechst33258染色試劑盒購于碧云天公司；Hoechst凋亡檢測(cè)試劑盒PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I購于BD 公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

大鼠肝癌RH-35細(xì)胞培養(yǎng)于含10%(體積分?jǐn)?shù))FBS、100 U/mL青霉素和鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，并置于37 ℃、飽和濕度、含5%(體積分?jǐn)?shù))CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d傳代1次。傳代后的對(duì)數(shù)期細(xì)胞經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的胰酶消化，稀釋至5×104個(gè)細(xì)胞/mL后接種于96孔板，每孔90 μL(約5×103個(gè)細(xì)胞)。顯微鏡下觀察鋪板密度均勻后，于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)條件為37 ℃、飽和濕度、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2。

1.2 ONC和VC單藥處理

在96孔板中分別加入10 μL系列稀釋的藥物，對(duì)照組加入10 μL磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)，單藥物組分為ONC組和VC組。ONC組藥物濃度依次為2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L、12 μmol/L和16 μmol/L，VC組藥物濃度依次為800 μmol/L、1 200 μmol/L、1 600 μmol/L、2 000 μmol/L和2 400 μmol/L，每個(gè)濃度5個(gè)復(fù)孔。

1.3 ONC和VC聯(lián)合用藥

以藥物的半抑制濃度(50% inhibitory concentration，IC50)為基準(zhǔn)，配制4種不同體積比(4∶1、3∶2、2∶3、1∶4)的混合藥液。以V(ONC)∶V(VC)= 4∶1為例，取體積分?jǐn)?shù)為80%IC50的ONC與體積分?jǐn)?shù)為20%IC50的VC進(jìn)行混合，混合后每種溶液用PBS連續(xù)稀釋，設(shè)定6個(gè)梯度。然后，各取10 μL混合藥液加入96孔板中，對(duì)照組加入10 μL PBS，每個(gè)濃度5個(gè)復(fù)孔，24 h后使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

1.4 SRB法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率

藥物處理24 h后，在培養(yǎng)孔中加入25 μL三氯乙酸固定1 h。洗滌細(xì)胞后加入50 μL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%的SRB溶液染色，使用體積分?jǐn)?shù)為1%的乙酸洗去多余染料并進(jìn)行干燥。然后，加入150 μL、10 mmol/L的三羥甲基氨基甲烷溶液振蕩溶解，使用酶標(biāo)儀在540 nm波長下測(cè)定吸光值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=(對(duì)照組吸光值-試驗(yàn)組吸光值)×100%/對(duì)照組吸光值。單藥組直線回歸可計(jì)算出藥物IC50值。聯(lián)合用藥組每種溶液可得到2個(gè)IC50，分別對(duì)應(yīng)ONC和VC。

1.5 聯(lián)合指數(shù)的計(jì)算

聯(lián)合指數(shù)(combination index,CI)指在聯(lián)合治療時(shí)，對(duì)某一效應(yīng)測(cè)量終點(diǎn)，定量測(cè)定藥物相互作用的程度。通過計(jì)算CI可初步確定兩種藥物的相互作用。若CI小于1，說明兩藥聯(lián)用具有協(xié)同效應(yīng)；若CI大于1，則表示兩藥聯(lián)用具有拮抗效應(yīng)[10]。CI的計(jì)算公式為CI=C50A/IC50A+C50B/IC50B，其中，C50A和C50B分別為A和B兩種藥物在聯(lián)用中達(dá)到50%抑制時(shí)的藥物濃度。CI即各藥物聯(lián)合用藥達(dá)到50%抑制時(shí)的藥物濃度與該藥單獨(dú)使用時(shí)的IC50之比的總和。

1.6 等效線圖解法分析

在CI的計(jì)算公式中，C50n/IC50n可用藥物分?jǐn)?shù)抑制濃度(fractional inhibitory concentration,FIC)表示，其中，n表示藥物A或藥物B。FIC在等效線中的位置可判定藥物間的相互作用。根據(jù)FIC的計(jì)算公式可以看出：單藥作用時(shí)FIC為1。以O(shè)NC的FIC值為橫坐標(biāo)，VC的FIC值為縱坐標(biāo)，連接兩種藥物單獨(dú)作用的坐標(biāo)，繪制出等效加成線。在藥物聯(lián)合作用時(shí)，根據(jù)兩種藥物的FIC值，可在等效分析圖上確定聯(lián)合作用的點(diǎn)。若該點(diǎn)位于等效加成線的下方，則代表兩種藥物聯(lián)用時(shí)具有協(xié)同作用。

1.7 Hoechst33258染色

藥物處理24 h后，加入體積分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌后加入Hoechst33258染色10 min，在Nikon Eclipse 80i型熒光顯微鏡下(激發(fā)波長約350 nm,發(fā)射波長約460 nm)觀察細(xì)胞核形態(tài)變化。

1.8 流式細(xì)胞法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況

用胰酶消化對(duì)數(shù)期細(xì)胞，并以2.0×105個(gè)細(xì)胞/孔的量接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后分為4組給藥，分別為PBS對(duì)照組、ONC單藥組(終濃度為8 μmol/L)、VC單藥組(終濃度為1 600 μmol/L)和聯(lián)合用藥組(V(ONC)∶V(VC)= 4∶1)。加藥處理24 h后，收集細(xì)胞，PBS洗滌2次，用1×結(jié)合緩沖液調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度，加入5 μL AnnexinV-PE和7-AAD混合染色液。在室溫避光條件下孵育15 min，加入400 μL 1×結(jié)合緩沖液，400目篩網(wǎng)過濾，1 h內(nèi)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件的單因素方差分析法分析數(shù)據(jù)組間差異，數(shù)據(jù)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.01表示差異顯著，P<0.001表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 SRB法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率

2.1.1 SRB法檢測(cè) ONC和VC對(duì)大鼠肝癌RH-35細(xì)胞的單獨(dú)作用

不同濃度的ONC和VC單藥處理RH-35細(xì)胞24 h后，使用SRB法檢測(cè)細(xì)胞生長抑制率。圖1為不同濃度單藥對(duì)RH-35細(xì)胞增殖的影響結(jié)果。圖1中，**表示與對(duì)照相比差異顯著，P<0.01。由圖1可知：隨著ONC和VC單藥濃度的增加，細(xì)胞存活的數(shù)目逐漸降低(P<0.01)，ONC和VC作用于RH-35細(xì)胞的IC50值分別為8 μmol/L和1 600 μmol/L。

(a) ONC對(duì)RH-35細(xì)胞的增殖抑制率

(b) VC對(duì)RH-35細(xì)胞的增殖抑制率

圖1 不同濃度單藥對(duì)RH-35細(xì)胞增殖的影響

2.1.2 SRB法檢測(cè)ONC和VC對(duì)大鼠肝癌RH-35細(xì)胞的聯(lián)合作用

表1 ONC與VC聯(lián)合作用于RH-35細(xì)胞的IC50值

ONC與VC以不同體積比(4∶1、3∶2、2∶3、1∶4)聯(lián)合后處理RH-35細(xì)胞的結(jié)果顯示：對(duì)照組細(xì)胞貼壁緊密，生長狀態(tài)良好，細(xì)胞核完整；聯(lián)合用藥組細(xì)胞增殖受到抑制，并呈現(xiàn)不同程度的凋亡。表1為SRB法測(cè)定ONC與VC聯(lián)合作用于RH-35細(xì)胞的IC50值。

2.2 CI值計(jì)算和等效性分析

根據(jù)CI值計(jì)算公式和表1中ONC與VC聯(lián)合作用的IC50值，計(jì)算出ONC與VC聯(lián)合作用于RH-35細(xì)胞的CI值和FIC值，如表2所示。由表2可知：4種體積比的CI值分別為0.78、0.83、0.85和0.97。CI值越小，協(xié)同效應(yīng)越明顯。作出ONC和VC聯(lián)合作用的等效性分析圖(見圖2)并確定出聯(lián)合作用的點(diǎn)。由圖2可見：4個(gè)聯(lián)合作用點(diǎn)均在等效加成線的下方。CI值計(jì)算結(jié)果和等效性分析結(jié)果均表明：ONC與VC能協(xié)同抑制RH-35細(xì)胞的增殖，且ONC與VC聯(lián)合用藥的最佳體積比為4∶1。

表2 ONC與VC聯(lián)合作用于RH-35細(xì)胞的

圖2 ONC和VC聯(lián)合作用的等效性分析圖

2.3 細(xì)胞形態(tài)的變化

藥物處理24 h后，倒置顯微鏡觀察RH-35細(xì)胞的形態(tài)，結(jié)果如圖3所示。由圖3a可以看出：PBS對(duì)照組的RH-35細(xì)胞形態(tài)正常，輪廓清晰，結(jié)構(gòu)緊密，貼壁牢靠，生長狀態(tài)良好。由圖3b、圖3c和圖3d可以看出：經(jīng)藥物處理后，單藥組和聯(lián)合用藥組(以RH-35細(xì)胞形態(tài)變化最明顯的V(ONC)∶V(VC)=4∶1組為例)的細(xì)胞密度均明顯降低，且均出現(xiàn)細(xì)胞皺縮與變形，細(xì)胞內(nèi)呈晶亮的小圓點(diǎn)，貼壁不緊甚至脫落死亡等現(xiàn)象。

(a) PBS組

(b) ONCIC50組

(c) VCIC50組

(d)V(ONC)∶V(VC)= 4∶1

圖3 藥物處理24 h后RH-35細(xì)胞形態(tài)

2.4 Hoechst染色法觀察細(xì)胞核的變化

核內(nèi)脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)斷裂、染色質(zhì)固縮、細(xì)胞核增大是細(xì)胞凋亡的顯著特征。用Hoechst染色法觀察藥物處理24 h后RH-35細(xì)胞核形態(tài)，結(jié)果如圖4所示。由圖4a可以看出：PBS對(duì)照組的RH-35細(xì)胞核完整，著色均勻。由圖4b、圖4c和圖4d可以看出：藥物處理組RH-35細(xì)胞核體積增大，并呈碎塊狀致密濃染，多處可見呈月牙形的典型凋亡現(xiàn)象和發(fā)芽起泡形成的凋亡小體(如圖4b、圖4c和圖4d中箭頭所示)。其中，聯(lián)合用藥組(以細(xì)胞核形態(tài)變化最明顯的V(ONC)∶V(VC)= 4∶1組為例)出現(xiàn)細(xì)胞核體積變大，染色質(zhì)凝聚、邊緣化，呈月形的典型凋亡現(xiàn)象，說明聯(lián)合用藥組促進(jìn)凋亡的效果優(yōu)于單藥組。

(a) PBS組

(b) ONCIC50組

>(c) VCIC50組

(d)V(ONC)∶V(VC)= 4∶1

圖4 藥物處理24 h后RH-35細(xì)胞核形態(tài)

2.5 凋亡檢測(cè)

采用Annexin V-PE/7-AAD雙染法結(jié)合流式細(xì)胞法，檢測(cè)ONC和VC對(duì)大鼠肝癌RH-35細(xì)胞凋亡的影響。研究結(jié)果表明：PBS對(duì)照組、ONC單藥組、VC單藥組和聯(lián)合用藥組(V(ONC)∶V(VC)= 4∶1)的細(xì)胞凋亡率分別為(4.24±0.36)%、(61.53±2.98)%、(15.73±3.08)%和(73.65±3.38)%。ONC單藥組和VC單藥組的細(xì)胞凋亡率與PBS對(duì)照組存在顯著差異(P<0.01)，且聯(lián)合用藥組的促進(jìn)凋亡作用優(yōu)于單藥組，與PBS對(duì)照組存在極顯著差異(P<0.001)。

3 討論

一般的腫瘤治療方法(化學(xué)藥物治療和放射治療)，在發(fā)揮破壞和殺傷腫瘤細(xì)胞作用的同時(shí)，對(duì)非腫瘤細(xì)胞(分裂期的正常細(xì)胞)也會(huì)產(chǎn)生較大損傷，且長期化療易產(chǎn)生抗藥性，導(dǎo)致治療效果下降。近年來，聯(lián)合藥物治療成為癌癥治療的新熱點(diǎn)。采用有協(xié)同作用的藥物聯(lián)合，有利于降低由單一藥物濃度高引起的藥物毒性和耐藥性，同時(shí)可調(diào)控異常細(xì)胞的多個(gè)信號(hào)通路，將治療效果最大化，可有效降低治療成本[11-12]。

ONC和VC的作用機(jī)制與現(xiàn)有腫瘤治療藥物有明顯區(qū)別。ONC可以直接降解tRNA殺傷腫瘤細(xì)胞，除了tRNA外，核糖體核糖核酸(ribosomal ribonucleic acid,rRNA)、信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid,mRNA)和微小核糖核酸(micro ribonucleic acid,miRNA)甚至它們的前體都是ONC的作用靶標(biāo)[13]，而VC通過在腫瘤細(xì)胞外產(chǎn)生大量的活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)，引起一系列的氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而造成DNA損傷，導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡[14]，因此兩者聯(lián)用的方案可能更具有臨床應(yīng)用潛力。本文以大鼠肝癌RH-35細(xì)胞為研究對(duì)象，采用SRB法和流式細(xì)胞法，測(cè)定ONC與VC對(duì)RH-35細(xì)胞的單獨(dú)以及聯(lián)合處理的凋亡效果，并用聯(lián)合指數(shù)和等效線圖解法分析評(píng)估聯(lián)合效果。單獨(dú)或聯(lián)合用藥均能有效促進(jìn)RH-35細(xì)胞凋亡，且聯(lián)合用藥的殺傷效果優(yōu)于單獨(dú)用藥。凋亡檢測(cè)結(jié)果提示ONC和VC具有協(xié)同作用，通過兩種藥物的聯(lián)合使用，可以顯著提高RH-35細(xì)胞的凋亡率。這與文獻(xiàn)[15]得到的ONC與其他腫瘤藥物聯(lián)用可有效提高腫瘤細(xì)胞的凋亡率的結(jié)論相一致。ONC和VC的協(xié)同作用機(jī)制推測(cè)可能與它們均能夠調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生ROS，進(jìn)而調(diào)控磷脂酰肌醇3-激酶信號(hào)通路誘導(dǎo)自噬發(fā)生，最終促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡有關(guān)[16]。

4 結(jié)論

(1)ONC和VC聯(lián)合用藥處理大鼠肝癌RH-35細(xì)胞，有效增強(qiáng)了藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力，證實(shí)ONC和VC在體外細(xì)胞水平上具有協(xié)同促進(jìn)RH-35細(xì)胞凋亡的作用。

(2)ONC和VC的協(xié)同作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究，并需要在體內(nèi)進(jìn)行驗(yàn)證，為兩者聯(lián)合用藥的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

(3)ONC和VC作為廣譜抗腫瘤藥物，研究結(jié)果對(duì)ONC和VC聯(lián)合處理其他實(shí)體腫瘤細(xì)胞也具有指導(dǎo)意義。