劉彩釗 王家雄 鄭愛(ài)燕 丁 潔 孟慶霞 李 紅 楊慎敏

南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院 生殖與遺傳中心（江蘇蘇州 215002）

男性不育目前已經(jīng)成為困擾很多家庭的問(wèn)題，影響男性生育力的因素很多， 其中遺傳缺陷導(dǎo)致的精子發(fā)生異常不容忽視。 遺傳因素相關(guān)的精子發(fā)生異常往往表現(xiàn)為嚴(yán)重男性不育， 如： 精子鞭毛多發(fā)形態(tài)異常（multiple morphological abnormalities of the sperm flagella,MMAF）[1]、 原發(fā)性纖毛運(yùn)動(dòng)障礙（primary ciliary dyskinesia,PCD）[2]、無(wú)頭精子癥（Acephalic Spermatozoa Syndrome，ASS）[3]、圓頭精子癥[4]等。 其中圓頭精子癥早在上個(gè)世紀(jì)70 年代就被報(bào)道[5]，具體表現(xiàn)為精子頭部小而圓、頂體缺失，部分病例出現(xiàn)尾部鞭毛的卷曲從而影響精子活動(dòng)能力[6]。圓頭精子癥是常染色體隱性遺傳病，目前已知的致病基因主要有DPY19L2（MIM:613893）、SPATA16（MIM:609856）和PICK1（MIM:605926），其中DPY19L2 缺陷最為常見(jiàn)[7]。 由于頂體的缺失，圓頭精子無(wú)法穿透卵子透明帶從而使卵子受精，因此，圓頭精子癥是一種嚴(yán)重的原發(fā)性不育。 從發(fā)現(xiàn)到現(xiàn)在，圓頭精子癥的輔助生殖結(jié)局就一直被關(guān)注， 由于無(wú)法穿透透明帶，在引入卵胞漿內(nèi)單精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）之前，并沒(méi)有針性治療方法[8]。 圓頭精子癥的ICSI 結(jié)局也不甚理想，總受精率仍低于50%[9]。 在此， 我們報(bào)道5 例在我院接受ICSI 治療的完全圓頭精子癥患者，采取卵子激活后，1 例成功生育健康子代。

材料與方法

一、研究對(duì)象

5 例均為原發(fā)不育，年齡23-37 歲，不育年限3-10年。 查體：男性第二性征發(fā)育正常，睪丸、附睪、輸精管均無(wú)異常，無(wú)精索靜脈曲張。 患者染色體核型分析均為46，XY，性激素檢測(cè)結(jié)果在正常參考值范圍。

二、方法

（一）樣本接收與常規(guī)檢測(cè)

患者禁欲2-7 天后手淫采集精液，液化后采用計(jì)算機(jī)輔助精液分析系統(tǒng)（Computer-aided Semen Analysis System ，CASA）（上海北昂醫(yī)藥科技股份有限公司）進(jìn)行精液常規(guī)分析，記錄精子濃度、活動(dòng)精子百分率、前向運(yùn)動(dòng)精子百分率。 采取精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析法（sperm chromatin structure assay，SCSA）分析精子DNA碎片化指數(shù)[10]。 患者1 進(jìn)行精子超微結(jié)構(gòu)、頂體檢測(cè)等試驗(yàn)，對(duì)5 例樣本均進(jìn)行遺傳分析。

（二）精子形態(tài)分析

按照《WHO 人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》第5版標(biāo)準(zhǔn)對(duì)精子進(jìn)行形態(tài)分析，采用改良巴氏染色液（南京欣迪生物藥業(yè)工程有限責(zé)任公司） 進(jìn)行精子涂片染色，1000 倍鏡觀察。

精子超微結(jié)構(gòu)觀察： 精液液化后，400g×15min 離心獲得新鮮的精子標(biāo)本，PBS 洗滌兩次， 加2.5%戊二醛溶液固定。梯度濃度乙醇脫水和滲透后，將用于透射電鏡的樣品包埋在Epon 812（SPI，美國(guó)）中，并用乙酸鈾酰和檸檬酸鉛對(duì)超薄切片進(jìn)行染色。 用透射電鏡（TECHAI-10，Philips，荷蘭）以80kV 的加速電壓觀察和記錄超微結(jié)構(gòu)。用離子噴霧儀（ACE200，Leica，德國(guó)）濺射涂覆用于掃描電鏡檢查的樣品，并通過(guò)掃描電鏡（Nova NanoSEM 450，F(xiàn)EI，美國(guó)）以5kV 的加速電壓進(jìn)行分析。

（三）精子頂體功能檢測(cè)

采用鈣離子載體（A23187，Sigma Aldrich，美國(guó)）誘導(dǎo)精子發(fā)生頂體反應(yīng)后，37℃、5%CO2下孵育15min， 將精子用PBS 洗滌3 次，涂在載玻片上并風(fēng)干。 隨后，將精子載玻片在室溫下用PBS-4%甲醛固定20min，然后在PBS中洗滌3 次。 將玻片用5%牛血清白蛋白（A8020;Solarbio， 中 國(guó)） 封 閉， 并 在4℃下 與 兔 抗CD46 一 抗（ab108307，Abcam，美國(guó)）一起孵育過(guò)夜。 之后，在室溫下與Cy3 偶聯(lián)的山羊抗兔IgG（GB21303，Servicebio，武漢，中國(guó)）孵育50min，用PBS 洗滌3 遍。 將載玻片用5 mg/mL DAPI（G1012，Servicebio，中國(guó)）復(fù)染，并用固定介質(zhì)（G1401，Servicebio，中國(guó)）固定。 用共聚焦顯微鏡（Nikon Eclipse CI，Nikon，Japan）捕獲熒光圖像。

（四）遺傳分析

使用DNeasy 血液和組織試劑盒（Qiagen，美國(guó)）從血液樣品中提取基因組DNA。 使用xGen Exome Research Panel V1.0（Integrated DNA Technologies，美國(guó)）制備樣品的全外顯子組測(cè)序。測(cè)序文庫(kù)的量通過(guò)Qubit 2.0 熒光計(jì)（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)）評(píng)估。文庫(kù)的質(zhì)量和大小通過(guò)2100Bioanalyzer 高靈敏度DNA 分析（Agilent Technologies，美國(guó)）進(jìn)行檢測(cè)。 將合格的文庫(kù)應(yīng)用于Illumina NovaSeq 平臺(tái)（Illumina，美國(guó)）上測(cè)序。通過(guò)BWA v0.7.13 將FASTQ 文件與人類參考基因組（hg19/GRCh37）對(duì)齊。 變體（單個(gè)核苷酸變體和插入/缺失）由GATK 4.0 從重新校準(zhǔn)的BAM 文件中進(jìn)行基因分型， 并使用ANNOVAR 針對(duì)多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行注釋，包括HGVS 變體描述、種群頻率、疾病或表型和變體功能預(yù)測(cè)。 按照美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)學(xué)會(huì)（American College of Medical Genetics and Genomics, ACMG）指南，將變體分類為致病性、可能致病性、未知意義的變體、可能為良性或良性變體?？截悢?shù)變異由DNAcopy R軟件包調(diào)用，按照ACMG 指南進(jìn)行過(guò)濾和分類，并使用Integrative Genomics Viewer 7 進(jìn)行手動(dòng)檢查。

（五）輔助生殖

女方采用長(zhǎng)刺激方案誘導(dǎo)排卵， 在黃體中期或口服避孕藥停藥前5～7 d 使用促性腺激素釋放激素， 在第15天測(cè)激素水平和B 超后開(kāi)始給予重組卵泡刺激素以刺激卵泡發(fā)育。當(dāng)至少兩個(gè)優(yōu)勢(shì)卵泡直徑達(dá)到18mm 時(shí)，注射250μg 重組人絨毛膜促性腺激素。 注射后36h 取卵，間隔4～6h 注射精子使M II 卵細(xì)胞受精，15min 后在培養(yǎng)基中加入鈣離子激動(dòng)劑（A23187,SigmaAldrich,USA）至終濃度為10μmol/L。 取卵72h 后移植，胚胎移植后第12 天檢測(cè)血清hCG，35 天后超聲發(fā)現(xiàn)胎心確定為臨床妊娠。

結(jié) 果

一、一般資料

5 例患者精子形態(tài)異常嚴(yán)重，正常形態(tài)精子百分率多次檢測(cè)均為0%，精液量正常，除患者2 外，精子濃度也在正常范圍（＞15×106/mL）。 除患者5 外，精子活動(dòng)力較正常參考值低。 患者1、2、3 精子DNA 碎片化指數(shù)分別為20.54，34.85 以及18.64，見(jiàn)表1。

表1 5 例圓頭精子癥患者的一般資料

二、精子形態(tài)

正常精子光學(xué)顯微鏡下觀察， 頭部呈光滑橢圓形，尾部正常舒展（圖1A），圓頭精子癥患者精子光學(xué)顯微鏡下呈圓形，頂體缺失，部分患者精子尾部鞭毛出現(xiàn)卷曲、短等嚴(yán)重畸形（圖1B），掃描電鏡下放大觀察亦是如此（圖1C-D）。透射電鏡下觀察，正常精子頭部核質(zhì)組裝緊密，頂體位于頭部前方，胞膜明顯（圖2E），而圓頭精子癥患者頭部不僅缺失頂體，而且核質(zhì)出現(xiàn)松散、空泡等異常（圖2F）。正常精子尾部鞭毛軸絲由1 對(duì)中央微管和9 對(duì)外周雙聯(lián)微管組成“9+2”結(jié)構(gòu)，外周由外周致密纖維和纖維鞘包裹（圖2G）；圓頭精子癥患者1，多數(shù)精子鞭毛也存在結(jié)構(gòu)組裝紊亂或微管缺失等異常（圖2H）。

圖1 光鏡和掃描電鏡下正常男性（A、C）和圓頭精子癥患者精子形態(tài)

圖2 透能電鏡下正常精子和圓頭精子超微結(jié)構(gòu)

三、精子頂體功能檢測(cè)

CD46 在精子中定位于頂體帽，其僅在精子頂體反應(yīng)后暴露于頂體內(nèi)膜表面。 正常男性精子通過(guò)鈣離子誘發(fā)頂體反應(yīng)后，CD46 暴露， 可以與CD46 特異性熒光抗體結(jié)合發(fā)出熒光，但是圓頭精子癥患者由于頂體結(jié)構(gòu)的缺失，無(wú)法發(fā)生頂體反應(yīng)，CD46 表達(dá)陰性，見(jiàn)圖3。

圖3 CD46 的免疫熒光顯示的正常（第1 行）和圓頭精子癥的患者（第2 行）中Ca2+離子誘導(dǎo)的頂體反應(yīng)

四、患者遺傳病因分析

患者1-4 接受全外顯子測(cè)序（whole exome sequencing，WES）檢測(cè)后未發(fā)現(xiàn)小片段缺失和突變，在進(jìn)行了CNV 分析后， 發(fā)現(xiàn)存在長(zhǎng)達(dá)十多萬(wàn)bp 的缺失， 而患者5 是大片段缺失與點(diǎn)突變的復(fù)合變異，見(jiàn)表2。

表2 5 例圓頭精子癥患者的遺傳病因

五、輔助生殖結(jié)局

患者1-5 受精率分別為83.3%（5/6）、60%（3/5）、28.6%（2/7）、0%（0/6）和0%（0/23），患者1 和患者2 胚胎移植后無(wú)臨床妊娠， 患者3 移植2 枚優(yōu)質(zhì)胚胎足月產(chǎn)2 孩，1 男1 女，如表3。

表3 患者輔助生殖臨床數(shù)據(jù)

討 論

精子形態(tài)在男性生育力評(píng)估中的作用舉足輕重，其中精子頭部畸形對(duì)精子質(zhì)量的影響尤為明顯。 精子頭部主要分為頂體區(qū)與頂體后區(qū)， 頂體后區(qū)即精子核質(zhì)部分。 頂體區(qū)域的異常會(huì)導(dǎo)致精子無(wú)法穿透卵子透明帶而核質(zhì)部分異常會(huì)使胚胎質(zhì)量下降。 圓頭精子癥是典型的精子頭部異常， 光鏡下通過(guò)頂體形態(tài)的差異可以分為完全圓頭精子癥和不完全圓頭精子癥。 完全圓頭精子癥是圓頭精子癥中嚴(yán)重的一類， 典型的特點(diǎn)是頂體的完全缺失； 而不完全圓頭精子癥患者的精子仍保留了部分頂體殘余[11]，此次研究入組的5 例患者均為完全圓頭精子癥。 伴隨著精子頭部形狀變化和頂體缺失的是精子核質(zhì)的異常，有研究發(fā)現(xiàn)，與正常男性相比， 圓頭精子癥患者精子的魚精蛋白缺乏， 而且DNA碎片率顯著增高[12]。 Perrin 等[13]在對(duì)圓頭精子癥的文獻(xiàn)回顧中發(fā)現(xiàn)， 圓頭精子癥患者不僅DNA 損傷增加，精子染色體非整倍體率也大幅增加。 這使得圓頭精子癥不僅難以穿透卵子透明帶，即使進(jìn)入卵子，由于精子遺傳物質(zhì)的缺陷也會(huì)導(dǎo)致胚胎發(fā)育潛能不足。 除了圓頭精子癥頭部形態(tài)的研究， 精子尾部也出現(xiàn)不同程度的畸形，但原因不詳[14,15]。 Ricci 等[16]認(rèn)為導(dǎo)致圓頭精子的頭部異常成熟的過(guò)程可能也導(dǎo)致了精子尾部在核周的纏繞，這個(gè)異常過(guò)程一直持續(xù)到其最終階段，因此最終變現(xiàn)出鞭毛的多次卷曲纏繞精子頭部。 而在本次研究中觀察到的患者精子不僅出現(xiàn)了典型的頭部缺陷，也伴隨了尾部的卷曲， 超微結(jié)構(gòu)觀察患者部分精子鞭毛微管結(jié)構(gòu)排列紊亂，也提示了在精子成熟過(guò)程中，影響頭部發(fā)育的遺傳缺陷也影響著精子尾部的組裝。 這說(shuō)明圓頭精子癥是一個(gè)精子整體的組裝障礙， 而不僅僅局限于頭部形態(tài)。 Sermondade 等[17]的研究采用鈣離子誘導(dǎo)了精子頂體反應(yīng)，并采用抗CD46 標(biāo)記了發(fā)生頂體反應(yīng)的頂體。 本研究中圓頭精子癥患者頂體反應(yīng)異常，也證實(shí)了患者由于精子頂體無(wú)法穿透卵子透明帶而導(dǎo)致原發(fā)性不育。

DPY19 樣蛋白2（DPY19L2）、 精子發(fā)生相關(guān)16（SPATA16）和C 激酶1 相互作用蛋白（PICK1），這三個(gè)蛋白編碼基因的變異被確定為圓頭精子癥的主要遺傳病因。DPY19L2 蛋白是睪丸特異性表達(dá)蛋白，有研究證明它是位于內(nèi)核膜上的跨膜蛋白， 它的缺失會(huì)導(dǎo)致頂體擴(kuò)散過(guò)程中存在于核/ 頂體交界處的分層結(jié)構(gòu)的破壞， 并最終導(dǎo)致頂體從核中脫離[18]。SPATA16 與PICK1 蛋白均定位于高爾基體中， 并在囊泡從高爾基體轉(zhuǎn)移到頂體以及頂體生物發(fā)生中發(fā)揮作用[19]，除此之外SPATA16 的小鼠模型試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)， 刪除Spata16 的第四個(gè)外顯子會(huì)導(dǎo)致雄性不育小鼠的生精阻滯， 說(shuō)明該基因?qū)τ谛∈笠约叭祟惖哪行陨扯际潜夭豢缮俚腫20]。最新的研究發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)新的圓頭精子癥致病基因ZPBP(MIM:608498)和CCDC62(MIM:613481)，這兩 個(gè)基因編碼的蛋白均位于精子頂體區(qū)域，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，其缺陷會(huì)導(dǎo)致精子頂體、頭部形態(tài)的發(fā)育異常[18]。 除此之外，在動(dòng)物模型中，還發(fā)現(xiàn)了圓頭精子癥潛在致病基因Hrb、Csnk2a2、GOPC， 但暫時(shí)沒(méi)有在人體中發(fā)現(xiàn)[21]。在所有的圓頭精子癥致病基因中，最普遍（60%～80%）的是DPY19L2， 其中大片段缺失占DPY19LL2 相關(guān)的圓頭精子癥的80.4%，而其余則是由基因內(nèi)的小片段缺失和點(diǎn)突變引起的[22]，而在本次研究納入的5 名患者均存在DPY19L2 基因的大片段缺失。

圓頭精子癥患者目前只能通過(guò)ICSI 生育， 但受精率、妊娠率和活產(chǎn)率均偏低[23]。 不同的遺傳缺陷患者的輔助生殖結(jié)局不同，攜帶PICK1 和SPATA16 致病突變的患者至今無(wú)ICSI 成功報(bào)道，部分DPY19L2 缺陷的患者可通過(guò)ICSI 成功生育[24]。 卵子活化是一個(gè)涉及鈣離子升高的過(guò)程， 過(guò)程中觸發(fā)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)存儲(chǔ)的鈣離子的反復(fù)振蕩。 精子進(jìn)入卵子使精子可溶因子擴(kuò)散，它們將磷脂酰肌醇4,5- 雙磷酸酯水解為肌醇1,4,5- 三磷酸酯（inositol triphosphate 3,IP3）和二酰基甘油。然后，IP3 與誘導(dǎo)鈣離子振蕩的特定受體結(jié)合，導(dǎo)致卵子活化，精子釋放的精子因子（如：震蕩蛋白、頂體后鞘WW 結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白等） 是否會(huì)引起鈣離子振蕩取決于精子攜帶的精子因子水平[25]。圓頭精子癥患者精子缺乏一種頂體磷脂酶——磷脂酶Cζ（phospholipase Cζ，PLCζ），從而導(dǎo)致卵子激活失敗。 目前人工卵母細(xì)胞活化（artificial oocyte activation，AOA）成為了提高圓頭精子癥患者生育可能的手段， 但安全性和有效性有待進(jìn)一步觀察[26]，而且圓頭精子癥伴隨的DNA 和染色質(zhì)異常也是降低ICSI 成功率的關(guān)鍵因素，Eskandari 等[12]發(fā)現(xiàn)，即使采取了AOA， 圓頭精子癥患者由于其精子染色質(zhì)包裝和DNA 碎片化最終會(huì)導(dǎo)致受精失敗或胚胎發(fā)育不良。 在本次研究中我們對(duì)圓頭精子癥患者均采取了AOA，但是結(jié)果仍然不理想。 同樣的遺傳缺陷和類似的精子表型，AOA 治療的結(jié)果卻存在不同，我們認(rèn)為可能與女方因素有關(guān)，也與操作中選擇的精子有關(guān)。 有研究報(bào)道雖然鈣離子AOA 可以改善圓頭精子癥ICSI 后的成功率， 但是其激活卵子的效率低于正常精子注射所誘導(dǎo)的效率[27]。 因此我們認(rèn)為圓頭精子癥ICSI 的成功關(guān)鍵是精子的選擇， 即在眾多頂體缺失的精子中盡最大努力挑出存在頂體殘余的精子注射， 該思路也得到了文獻(xiàn)的驗(yàn)證[17]。 因此，對(duì)于圓頭精子癥患者的ICSI 治療，如果有條件的單位， 我們建議采用胞漿內(nèi)形態(tài)選擇精子注射（intracytoplasmic morphologically selected sperm injection，IMSI）結(jié)合AOA 的方法，而不是單純的不挑選優(yōu)秀形態(tài)的精子僅僅采用AOA 治療。

綜上所述，雖然完全圓頭精子癥的臨床表型明確，多數(shù)病例的遺傳學(xué)病因也比較清晰， 但是目前仍沒(méi)有可靠的手段可以提高該類患者的輔助生殖結(jié)局。 該類患者的遺傳檢測(cè)十分必要， 有研究者推薦不僅需要對(duì)圓頭精子癥患者進(jìn)行遺傳檢測(cè)， 其女性伴侶如果是近血緣婚姻后代或出生在封閉社會(huì)環(huán)境， 也需要對(duì)她們進(jìn)行DPY19L2 缺失的篩查， 如果伴侶也存在該基因的雜合缺失， 則需要適當(dāng)?shù)倪x擇植入前基因測(cè)試來(lái)挑選健康的胚胎以避免出生同樣患有圓頭精子癥的男嬰[28]。