俞蕾媛 盛少琴 潘弘毅 劉佳俐 范夢夢 潘鴻燕

1.浙江中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院 杭州 310053 2.浙江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院 3.浙江中醫(yī)藥大學第三臨床醫(yī)學院 4.云和縣中醫(yī)院

剖宮產(chǎn)后瘢痕缺損（previous cesarean scar defect，PCSD）是指剖宮產(chǎn)切口愈合不良，形成缺損。再次妊娠時，若孕囊種植于缺損處，則可導(dǎo)致大出血、子宮破裂，甚至孕產(chǎn)婦死亡[1]。目前臨床上尚缺乏治療PCSD的可靠方法，因此如何有效防治療PCSD成為臨床迫切需要解決的難點。剖宮產(chǎn)術(shù)后子宮切口愈合是一個多細胞參與的復(fù)雜過程，由于平滑肌組織再生能力較弱，大部分愈合以纖維性修復(fù)為主。創(chuàng)傷愈合早期，富含毛細血管的肉芽組織可在短時間內(nèi)填補創(chuàng)面，維持組織器官完整性，同時可以預(yù)防感染，其形成有賴于成纖維細胞的遷移、黏附、增殖及愈合相關(guān)蛋白的分泌[2-3]。因此，促進成纖維細胞的遷移、黏附、增殖及愈合相關(guān)蛋白的分泌，將有助于促進子宮切口愈合。

中醫(yī)認為本病多由血瘀所致，兼夾氣血虧虛，治療當以益氣養(yǎng)血、化瘀生新為主，輔以清熱解毒。三七重樓生化湯（Sanqi Chonglou Shenghua Decoction，SCD）為我科經(jīng)驗方，該方由生化湯加味而成，具有抗炎抑菌、化瘀生新之效，可改善機體的血液循環(huán)狀態(tài)，促進創(chuàng)面的愈合。臨床研究已證實，該方對剖宮產(chǎn)術(shù)后子宮切口愈合不良、惡露不絕、子宮復(fù)舊不良等均有良好療效[4-5]。但作為中藥復(fù)方方劑，其藥效機制尚不明確。故本研究擬體外培養(yǎng)小鼠成纖維細胞，探討SCD對成纖維細胞功能及對細胞因子分泌的影響，為臨床藥理研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細胞 小鼠成纖維細胞系L929由浙江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院中心實驗室饋贈。選擇含10%胎牛血清、100U·mL-1青霉素、100mg·L-1鏈霉素的杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基（dulbecco's modified eagle medium，DMEM），于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期觀察細胞生長情況，每2d換液一次。

1.2 主要藥品與試劑 SCD組方包括三七3g、重樓3g、當歸20g、桃仁10g、川芎10g、益母草30g、黃芪10g、生姜6g、甘草6g，藥物由浙江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院藥劑科提供。以上藥物以去離子水常規(guī)煎煮2次，濃縮后過濾除菌、分裝，-20℃保存?zhèn)溆?。前期研究中采用細胞增殖檢測實驗篩選出SCD最佳濃度，分為低、中、高3個濃度梯度，分別為1.25、2.5、5mg·mL-1。DMEM高糖培養(yǎng)基、胰酶、胎牛血清均購于美國Gibco公司（批號：C11995500BT、25200056、10091-141）；磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）、青霉素鏈霉素溶液均購于杭州諾森德生物技術(shù)有限公司（批號：C10010、C15140）；β-肌動蛋白（β-actin）小鼠單克隆抗體、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）兔多克隆抗體、血管內(nèi)皮生長因子-A（vascular endothelial growth factor-A，VEGF-A）兔單克隆抗體、細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinases 1/2，ERK1/2）兔多克隆抗體、磷酸化細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（phospho-extracellular regulated protein kinases 1/2，p-ERK1/2）兔多克隆抗體、山羊抗兔二抗（goat anti rabbit IgG）、山羊抗小鼠二抗（goat anti mouse IgG）均購于美國Abcam公司 （批號：ab8226、ab179695、ab52917、ab17942、ab47339、ab205 718、ab205719）； 二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒購于碧云天生物技術(shù)有限公司（批號：P0012）；細胞增殖檢測試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）購于日本東仁公司（批號：CK04）。

1.3 主要儀器 CO2細胞培養(yǎng)箱、生物安全柜為美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品；倒置顯微鏡購于日本Olympus公司；實時無標記細胞分析儀購于美國ACEA公司；酶標儀購于美國BioTek公司；電泳儀為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；凝膠成像儀購于美國Protein Simple公司。

1.4 細胞增殖檢測

1.4.1 實時細胞分析技術(shù)（real time cellular analysis，RTCA） 在96孔電子培養(yǎng)板中加入培養(yǎng)基獲取基線數(shù)據(jù)，取對數(shù)生長期的L929細胞，按5×103個/孔細胞數(shù)接種于96孔培養(yǎng)板中，室溫靜置30min后置于RTCA儀上，37℃、5% CO2條件下連續(xù)監(jiān)測24h。吸出原培養(yǎng)基，分別予低、中、高濃度SCD（1.25、2.5、5mg·mL-1），對照組予等體積培養(yǎng)基，繼續(xù)監(jiān)測24h，獲取細胞指數(shù)（cell index，CI）。

1.4.2 CCK-8法 取對數(shù)生長期的L929細胞，按5×103個/孔細胞數(shù)接種于96孔板中，37℃、5% CO2孵育24h。吸出原培養(yǎng)基，分別予低、中、高濃度SCD（1.25、2.5、5mg·mL-1），對照組予等體積培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h。更換培養(yǎng)基，每孔加入10μL的CCK-8試劑，37℃孵育2h，酶標儀測定450nm處的吸光度（optical density，OD）。

1.5 細胞黏附檢測

1.5.1 RTCA 96孔電子培養(yǎng)板中加入培養(yǎng)基獲取基線數(shù)據(jù)，取對數(shù)生長期的L929細胞，按2×104個/孔細胞數(shù)接種于培養(yǎng)板中，同時予低、中、高濃度SCD（1.25、2.5、5mg·mL-1），對照組予等體積培養(yǎng)基，37℃、5% CO2條件下連續(xù)監(jiān)測5h獲取CI。

1.5.2 CCK-8法 取對數(shù)生長期的L929細胞，按2×104個/孔細胞數(shù)接種于培養(yǎng)板中，同時加入低、中、高濃度SCD（1.25、2.5、5mg·mL-1），對照組予等體積培養(yǎng)基，37℃、5% CO2孵育5h后更換培養(yǎng)基，每孔加入10μL的CCK-8試劑，37℃孵育2h，酶標儀測定450nm的OD。

1.6 細胞遷移檢測 采用劃痕實驗檢測細胞遷移。取對數(shù)生長期的L929細胞，按2×105個/孔細胞數(shù)接種于6孔板中，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24h，以200μL移液器吸頭在培養(yǎng)板孔內(nèi)劃線，PBS洗滌3次，更換為含0.5%血清的培養(yǎng)基并加入低、中、高濃度（1.25、2.5、5mg·mL-1）SCD，對照組予等體積培養(yǎng)基，分別于12、24、36h拍照記錄細胞遷移情況，以Image J圖像處理軟件進行定量分析。

1.7 Western blot檢測愈合相關(guān)蛋白表達 取對數(shù)生長期的L929細胞，按3×105個/孔細胞數(shù)接種于6孔板中，培養(yǎng)24h后分別用低、中、高濃度SCD（1.25、2.5、5mg·mL-1）干預(yù)，對照組予等體積培養(yǎng)基。37℃、5% CO2培養(yǎng)24h后吸出培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，加入放射免疫沉淀法緩沖液（radioimmunoprecipitation assay buffer，RIPA）后在冰上充分裂解。4℃下12 000r/min離心10min，收集上清液，BCA法測定總蛋白濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離后，轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF），室溫封閉2h，加入一抗4℃孵育過夜。次日，加入二抗室溫孵育2h，洗膜后電化學發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）試劑顯色。以β-actin為內(nèi)參，對蛋白質(zhì)條帶的灰度進行半定量分析。

1.8 統(tǒng)計學分析 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以±s表示，兩組間比較采用非配對雙尾t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，方差齊時進一步兩兩比較采用最小顯著差異（least significant difference，LSD）法，方差不齊時采用Dunnett法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞增殖比較 CCK-8結(jié)果示：與對照組比較，SCD各濃度組L929細胞增殖能力顯著提升（P＜0.01）。與低濃度組比較，中、高濃度組促增殖作用更顯著（P＜0.01）。與中濃度組比較，高濃度組促增殖作用更顯著（P＜0.05）。見圖1A。

RTCA結(jié)果示：SCD干預(yù)后CI在短暫下降后上升。干預(yù)30h，與對照組比較，SCD低濃度組CI顯著增高（P＜0.01）。干預(yù)36h，各組CI差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。干預(yù)42h，與對照組、SCD低濃度組比較，中、高濃度組CI顯著增高（P＜0.01），但中、高濃度組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。干預(yù)48h，與對照組比較，SCD中、高濃度組CI顯著增高（P＜0.01），但中、高濃度組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與低濃度組比較，高濃度組CI顯著增高（P＜0.05）。見圖1B、表1。

2.2 各組細胞黏附比較 CCK-8結(jié)果提示，與對照組比較，SCD各濃度組L929細胞黏附能力顯著提高（P＜0.01），但各濃度組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖2A。

RTCA結(jié)果提示，與對照組比較，干預(yù)各時點SCD各濃度組L929細胞黏附能力顯著提高（P＜0.01），但各濃度組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖2B、表2。

圖1 各組細胞增殖比較Fig.1 Comparison of cell proliferation in each group

表1 RTCA各時間點各組細胞增殖比較（±s，n=3）Tab.1 Comparison of cell proliferation at different time points of RTCA（±s，n=3）

表1 RTCA各時間點各組細胞增殖比較（±s，n=3）Tab.1 Comparison of cell proliferation at different time points of RTCA（±s，n=3）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與SCD低濃度組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note:Compared with control group，**P＜0.01;compared with SCD low dose group，#P＜0.05;##P＜0.01

組別 30h 36h 42h 48h對照組 1.06±0.07 1.20±0.03 1.36±0.01 1.62±0.09 SCD 低濃度組 1.46±0.04** 1.29±0.08 1.43±0.11 1.72±0.06 SCD 中濃度組 1.19±0.06## 1.29±0.10 1.76±0.08**## 1.90±0.08**SCD 高濃度組 1.09±0.13## 1.35±0.22 1.90±0.19**## 1.94±0.14**#

圖2 各組細胞黏附比較Fig.2 Comparison of cell adhesion in each group

表2 RTCA各時間點各組細胞黏附比較（±s，n=3）Tab.2 Comparison of cell adhesion at different time points of RTCA（±s，n=3）

表2 RTCA各時間點各組細胞黏附比較（±s，n=3）Tab.2 Comparison of cell adhesion at different time points of RTCA（±s，n=3）

注：與對照組比較，**P＜0.01Note:Compared with control group，**P＜0.01

組別 1h 2h 3h 4h 5h對照組 0.02±0.01 0.03±0.01 0.04±0.01 0.05±0.01 0.06±0.01 SCD 低濃度組 0.07±0.01** 0.10±0.00** 0.12±0.01** 0.14±0.01** 0.17±0.02**SCD 中濃度組 0.07±0.01** 0.10±0.00** 0.11±0.00** 0.13±0.01** 0.16±0.01**SCD 高濃度組 0.08±0.01** 0.11±0.01** 0.13±0.01** 0.15±0.01** 0.18±0.02**

2.3 各組細胞遷移比較 干預(yù)12h，各組劃痕愈合百分比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。干預(yù)24h，與對照組比較，SCD中、高濃度組劃痕愈合百分比顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）；且與低、中濃度組比較，高濃度組愈合百分比增加更明顯（P＜0.01）。干預(yù)36h，與對照組比較，SCD各濃度組劃痕愈合百分比均顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）。與低濃度組比較，SCD中、高濃度組劃痕愈合百分比顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。與中濃度組比較，SCD高濃度組劃痕愈合百分比顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖3、表3。

2.4 各組細胞VEGF、TGF-β1、ERK1/2、pERK1/2蛋白表達比較 各組細胞TGF-β1及ERK1/2表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與對照組比較，SCD中、低濃度組VEGF、p-ERK1/2的表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與對照組、SCD中、低濃度組比較，高濃度組VEGF、p-ERK1/2表達顯著增加（P＜0.01）。見圖4。

3 討論

圖3 各組成纖維細胞遷移比較（40×）Fig.3 Comparison of fibroblasts migration in each group（40×）

表3 各組劃痕愈合百分比（±s，n=3）Tab.3 Percentage of wound area in each group （±s，n=3）

表3 各組劃痕愈合百分比（±s，n=3）Tab.3 Percentage of wound area in each group （±s，n=3）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與SCD低濃度組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與SCD中濃度組比較，△△P＜0.01Note:Compared with control group，*P＜0.05，**P＜0.01;compared with SCD low dose group，#P＜0.05，##P＜0.01;compared with SCD medium dose group，△△P＜0.01

組別 12h 24h 36h對照組 13.46±2.50 22.56±1.06 31.89±2.05 SCD 低濃度組 13.57±1.37 25.27±2.47 39.06±4.27*SCD 中濃度組 14.82±2.12 26.05±2.11* 44.60±2.94**#SCD 高濃度組 16.03±2.43 39.32±1.32**##△△ 53.17±1.26**##△△

圖4 各組細胞VEGF、TGF-β1、ERK1/2、pERK1/2蛋白表達比較Fig.4 Comparison of VEGF，TGF-β1，ERK1/2，pERK1/2 expression in each group

PCSD 是剖宮產(chǎn)術(shù)后的遠期并發(fā)癥之一，嚴重影響婦女的身體健康及生活質(zhì)量，同時會對再次妊娠帶來子宮破裂和憩室妊娠的巨大風險。目前臨床上尚缺乏治療PCSD的可靠方法，因此如何有效預(yù)防PCSD、促進子宮切口愈合成為臨床上亟需解決的難題。與其他類型的創(chuàng)傷愈合同樣，剖宮產(chǎn)術(shù)后子宮切口愈合也是一個復(fù)雜有序的生物學過程，涉及多種細胞和生長因子。目前認為，創(chuàng)傷愈合遵循三個基本階段，即炎癥階段、增殖階段和重塑階段。成纖維細胞參與創(chuàng)傷愈合全過程，在細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）沉積與重塑、傷口收縮中發(fā)揮重要作用[6-7]。組織損傷時，成纖維細胞在炎癥因子的介導(dǎo)下遷移到損傷部位并黏附于ECM上，增殖并合成分泌ECM和生長因子（VEGF、TGF-β1等）以促進傷口愈合，其生物學行為直接決定了組織修復(fù)的速度與質(zhì)量。

中醫(yī)認為創(chuàng)傷可致局部氣血瘀滯、經(jīng)絡(luò)阻塞，故治療首先需要祛瘀，否則“瘀血不去，新血不生”?！案ゼ∩?，肌平皮長”是創(chuàng)傷愈合的自然規(guī)律，故亦可予“去腐生肌”類藥物治療，加速壞死組織清除及肉芽組織生長[8]。三七重樓生化湯是我科自擬經(jīng)驗方，其中三七活血化瘀、和營止血，可以抑制受損組織釋放自由基并能改善局部血液循環(huán)[9]；重樓清熱解毒、消腫止痛，具有抑菌、抗炎、抗氧化的功效[10]。臨床研究證實該方對PCSD具有良好療效，但其作用機制尚不明確。本研究選取小鼠成纖維細胞L929作為研究對象，通過CCK-8、RTCA檢測細胞增殖及黏附，結(jié)果提示：SCD干預(yù)后L929細胞增殖呈動態(tài)變化，在最初6h內(nèi)低濃度SCD能促進L929細胞增殖；干預(yù)12～24h中、高濃度能促進L929細胞增殖，且SCD濃度越高，促進增殖作用越明顯。黏附實驗結(jié)果表明，SCD具有促黏附作用，但不同濃度間差異無統(tǒng)計學意義。劃痕實驗結(jié)果顯示，在最初12h各組細胞遷移差異無統(tǒng)計學意義；干預(yù)24h，中、高濃度SCD表現(xiàn)出促進遷移的作用，且高濃度促進作用更強；隨著干預(yù)時間達到36h，低、中、高濃度SCD均具有促進遷移的作用，且SCD濃度越高，作用越顯著。由此推測，SCD可以促進成纖維細胞增殖、遷移、黏附，且其作用具有一定時間與濃度依賴性。干預(yù)后短時間內(nèi)，藥物濃度間差異并不顯著，而隨時間推移，逐漸表現(xiàn)出濃度依賴性，這一發(fā)現(xiàn)對臨床用藥時間間隔、劑量選擇具有指導(dǎo)意義。

VEGF是一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細胞生長因子，可刺激血管生成并增加血管通透性，在創(chuàng)傷愈合過程中有利于營養(yǎng)物質(zhì)及代謝產(chǎn)物的運輸，從而改善傷口局部微環(huán)境；其非血管作用包括激活成纖維細胞，促進膠原蛋白沉積[11-12]。TGF-β1具有強烈促傷口愈合作用，可通過經(jīng)典的轉(zhuǎn)化生長因子-SMAD（transforming growth factor-SMAD，TGF-SMAD） 蛋白途徑促進成纖維細胞合成和膠原分泌，有助于減少創(chuàng)面面積；同時還可促進成纖維細胞增殖和向肌成纖維細胞分化，提高創(chuàng)面張力，加速傷口閉合[13-14]。本研究通過Western blot技術(shù)檢測SCD干預(yù)后成纖維細胞VEGF、TGF-β1蛋白的表達，結(jié)果提示低、中、高濃度SCD均不影響TGF-β1蛋白表達；高濃度SCD可顯著提高VEGF蛋白水平，而低、中濃度SCD促進VEGF分泌的功效不明顯。上述結(jié)果提示SCD可能通過上調(diào)VEGF表達來改善成纖維細胞的血供和氧供狀態(tài)，同時刺激成纖維細胞的增殖、黏附、遷移，從而促進剖宮產(chǎn)切口愈合。

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）信號通路廣泛參與細胞病理生理效應(yīng)[15]。研究證實，MAPK信號通路特別是ERK1/2的活化，對組織損傷后應(yīng)激反應(yīng)至關(guān)重要[16-17]。包括VEGF在內(nèi)的組織損傷相關(guān)因子可激活ERK1/2信號通路，并通過促進細胞定向遷移、黏附、增殖等發(fā)揮促進創(chuàng)面愈合的作用。本研究發(fā)現(xiàn)低、中濃度SCD均不改變ERK1/2蛋白磷酸化水平，而高濃度SCD干預(yù)后，成纖維細胞ERK1/2蛋白的磷酸化水平明顯上調(diào)，該結(jié)果提示SCD激活的成纖維細胞增殖、遷移、黏附可能與ERK1/2蛋白磷酸化增強有關(guān)，而ERK1/2蛋白磷酸化水平提高可能是VEGF表達上調(diào)的結(jié)果。

綜上所述，本研究提示SCD能夠明顯提高成纖維細胞的增殖、黏附及遷移能力，并能上調(diào)愈合相關(guān)蛋白VEGF的表達，進而活化ERK1/2蛋白，發(fā)揮促進PCSD傷口愈合的功效，然而其確切機制仍不清楚，后續(xù)將進一步深入研究，為SCD的開發(fā)、應(yīng)用提供實驗依據(jù)，也為PCSD的防治提供更多可靠的方法。