權(quán)利要求書

1. 一種纖維素酶的制備方法， 其特征在于：所述纖維素酶使用的生產(chǎn)菌株為里氏木霉（Trichoderma reesei），其保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址是北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學院微生物研究所，保藏日期2008年11月25日，保藏號為CGMCC No.2785。

所述纖維素酶的制備方法如下：將里氏木霉試管斜面菌種接入液體種子發(fā)酵罐（1）中進行種子發(fā)酵得到所需要的液體種子，然后按照一定的接種量將液體種子接入纖維素酶發(fā)酵罐（2），并且在一定的發(fā)酵工藝條件下發(fā)酵，最后經(jīng)過離心分離制得所需纖維素酶酶液，并將其儲存在纖維素酶存儲罐（3）中以備用。 所述發(fā)酵工藝參數(shù)如下：

（1）里氏木霉試管斜面培養(yǎng)基：1%～2%CMC，4%～8%營養(yǎng)元素液，0.1%～0.5%微量元素液，2%～3%瓊脂，pH=6.0；

（2）里氏木霉菌種的培養(yǎng)：將菌種接于斜面培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)箱中于（29±1） ℃條件下培養(yǎng)4～7 d 后使用或4 ℃下保存?zhèn)溆茫?/p>

（3）液體種子發(fā)酵培養(yǎng)基：1%～3%葡萄糖，4%～8%營養(yǎng)元素液，1%～4%麩皮，0.1%～0.4%微量元素液；

（4）纖維素酶發(fā)酵培養(yǎng)基：碳源為0.1%～3%速生材硫酸鹽漿，8%～10%營養(yǎng)元素液，0.2%～0.5%微量元素液，1%～4%麩皮，0.1%～0.2%表面活性劑Tween-80；

（5）液體種子發(fā)酵條件：溫度30～40 ℃，pH=5～7，攪拌速度250～300 r/min，通風量0.2～0.3 m3/h，發(fā)酵時間36～48 h；

（6）纖維素酶發(fā)酵條件：溫度30～40 ℃，pH=5～8，接種量2%～3%，攪拌速度250～300 r/min，通風量0.2～0.3 m3/h，發(fā)酵時間72～96 h。

所述營養(yǎng)元素液其配方為：3～10 g 檸檬酸鈉，5～20 g 磷酸二氫鉀，1～10 g 硫酸銨，0.5～5 g 硫酸鎂，0.1～5 g 氯化鈣，溶解后定容至100 mL。

所述微量元素液配方為：1～5 g 硫酸亞鐵，0.1～1 g硫酸錳，0.1～1 g 氯化鋅，0.5～5 g 氯化鈷，1～10 mL 2 mol/L 的HCl，溶解后定容到100 mL；上述所有百分比均以質(zhì)量計。

2. 權(quán)利要求1 所述的方法，其特征在于：所述碳源為思茅松硫酸鹽漿。

3. 權(quán)利要求 所述的方法，其特征在于：酶液的制備過程中，種子發(fā)酵培養(yǎng)基采用1%葡萄糖、4%營養(yǎng)元素液、1%麩皮、0.1%微量元素液，在溫度30 ℃、pH=6、攪拌速度250 r/min、通風量0.2 m3/h 的條件下發(fā)酵48 h，得到所需要的液體種子；然后按照2%的接種量，將種子接入纖維素酶發(fā)酵罐（2），發(fā)酵培養(yǎng)基采用碳源為0.1%的速生材硫酸鹽漿、8%營養(yǎng)元素液、0.2%微量元素液、1%麩皮、0.2%表面活性劑Tween-80，在溫度30 ℃、pH=6、接種量2%、攪拌速度300 r/min、通風量0.3 m3/h 的條件下發(fā)酵96 h。

4. 一種采用權(quán)利要求1 所述方法制得的纖維素酶用于酶促打漿的方法，其特征在于：紙漿為速生材硫酸鹽漿， 按照權(quán)利要求1 所述的方法制備纖維素酶并將其儲存在纖維素酶存儲罐中以備用， 將纖維素酶存儲罐（3）中的酶液通過計量泵以7 u/g 的酶用量以FPA 酶活為單位，輸送到紙漿反應池（4）對紙漿進行預處理，處理條件為漿濃10%、溫度50 ℃、pH=7.8、處理時間1 h，經(jīng)纖維素酶處理后的紙漿輸送到盤磨機(5)進行打漿。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種纖維素酶酶促打漿工藝， 尤其涉及一種里氏木霉液體深層發(fā)酵纖維素酶及其酶促打漿工藝。

背景技術(shù)

打漿是制漿造紙過程的重要環(huán)節(jié)， 對紙幅的物理性能產(chǎn)生效應。然而，打漿是一耗能工段。為了得到所需要的紙漿性質(zhì)， 打漿或磨漿將消耗大量的能源，大約占從原料到成紙所需總能源的18%。 因此，任何能夠顯著降低打漿或磨漿能耗的紙漿處理方法將對整個能量輸入產(chǎn)生有益影響。

Pratima Bajpai 發(fā)表在《TAPPI Journa1》2006年第5 卷11 期第25—32 頁“Use of enzymes for reduction in refining energy-laboratory studies”一文的研究表明：印度Biocon 公司的Biorefine L 纖維素酶和美國Dyadic 國際公司的FiberZyme LBR 纖維素酶能夠有利地降低打漿能耗， 并且紙漿的強度性能沒有受到影響。

鞠成民發(fā)表在《中國造紙》2006年第25 卷1 期第71—72 頁 “生物酶對未漂針葉木打漿性能的影響” 一文中介紹了N613、N476、N342、HC、D401 和D501 等諾維信商品纖維素酶和半纖維素酶在提高打漿性能和改善紙漿強度方面的影響。

上述研究所用的纖維素酶都為商品酶， 并非根據(jù)實際情況而自制纖維素酶用于酶促打漿。 由于現(xiàn)在商品纖維素酶價格比較高， 使得工廠使用起來成本很高；此外，國內(nèi)的造紙原料短缺，大部分速生木材如馬尾松、 落葉松和思茅松等針葉木的纖維又粗又長，其硫酸鹽漿很難打漿，使得商品漿的市場競爭力弱，經(jīng)濟效益差。 為此，紙業(yè)界亟待開發(fā)根據(jù)生產(chǎn)廠的具體情況， 采用就地自制的纖維素酶酶液進行酶促打漿工藝， 以達到降低生產(chǎn)成本和打漿能耗的效果。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種里氏木霉液體深層發(fā)酵纖維素酶及其酶促打漿工藝， 使用里氏木霉液體深層發(fā)酵纖維素酶對速生材硫酸鹽漿進行酶促打漿，可降低打漿能耗和生產(chǎn)成本。

本發(fā)明為實現(xiàn)上述目的，采用的技術(shù)方案如下：

一種纖維素酶， 其特征在于所使用的生產(chǎn)菌株為里氏木霉（Trichoderma reesei），保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心， 地址是北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學院微生物研究所，保藏日期2008年11月25日，保藏號為CGMCCNo.2785。 里氏木霉為好氧菌，生長環(huán)境粗放，適應性較強，易于控制，便于管理，其代謝物安全無毒，不會影響生產(chǎn)人員和環(huán)境，所產(chǎn)纖維素酶的穩(wěn)定性好，不宜退化。

纖維素酶的制備方法如下： 將里氏木霉試管斜面菌種接入液體種子發(fā)酵罐中進行種子發(fā)酵得到所需要的液體種子； 然后按照一定的接種量將液體種子接入纖維素酶發(fā)酵罐， 并且在一定的發(fā)酵條件下發(fā)酵，最后經(jīng)過離心分離制得所需纖維素酶酶液，并將其儲存在纖維素酶存儲罐中以備用。

發(fā)酵工藝參數(shù)如下：

（1）里氏木霉試管斜面培養(yǎng)基：1%～2% CMC，4%～8%營養(yǎng)元素液，0.1%～0.5%微量元素液，2%～3%瓊脂，pH=6.0；

（2）里氏木霉菌種的培養(yǎng)：將菌種接于斜面培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)箱中于（29±1） ℃條件下培養(yǎng)4～7 d 后使用或4 ℃下保存?zhèn)溆茫?/p>

（3） 液體種子發(fā)酵培養(yǎng)基：1%～3%葡萄糖，4%～8%營養(yǎng)元素液，1%～4%麩皮，0.1%～0.4%微量元素液；

（4）纖維素酶發(fā)酵培養(yǎng)基：碳源為0.1%～3%速生材硫酸鹽漿，8%～10%營養(yǎng)元素液，0.2%～0.5%微量元素液，1%～4%麩皮，0.1%～0.2%表面活性劑Tween-80 ；

（5）液體種子發(fā)酵條件：溫度30～40 ℃，pH=5～7，攪拌速度250～300 r/min，通風量0.2～0.3 m3/h，發(fā)酵時間36～48 h；

（6）纖維素酶發(fā)酵條件：溫度30～40 ℃，pH=5～8，接種量2%～3%，攪拌速度250～300 r/min，通風量0.2～0.3 m3/h，發(fā)酵時間72～96 h；

所述營養(yǎng)元素液的配方為：取3～10 g 檸檬酸鈉，5～20 g 磷酸二氫鉀，1～10 g 硫酸銨，0.5～5 g 硫酸鎂，0.1～5 g 氯化鈣，溶解后定容至100 mL；

所述微量元素液配方為：1～5 g 硫酸亞鐵，0.1～1 g硫酸錳，0.1～1 g 氯化鋅，0.5～5 g 氯化鈷，1～10 mL 2 mol/L 的HCl，溶解后定溶到100 mL；上述所有百分比均以質(zhì)量計。

在本發(fā)明的纖維素酶的制備方法中， 所用的發(fā)酵碳源為思茅松硫酸鹽漿。

在本發(fā)明的纖維素酶的制備方法中，其酶液的制備過程中， 種子發(fā)酵培養(yǎng)基采用：1%葡萄糖，4%營養(yǎng)元素液，1%麩皮，0.1%微量元素液，在溫度30 ℃，pH=6，攪拌速度250 r/min，通風量0.2 m3/h 的條件下發(fā)酵48 h， 得到所需要的液體種子； 然后按照2%的接種量，將種子接入纖維素酶發(fā)酵罐，發(fā)酵培養(yǎng)基采用：碳源為0.1%的速生材硫酸鹽漿，8%營養(yǎng)元素液，0.2%微量元素液，1%麩皮，0.2%表面活性劑Tween-80， 在溫度30℃，pH=6；接種量2%，攪拌速度300 r/min；通風量0.3m3/h 的條件下發(fā)酵96 h。

用本發(fā)明的纖維素酶的制備方法所制得的纖維素酶產(chǎn)品的性能：纖維素酶酶液的酶活分別為FPA 酶活為900～1500 u/mL，Cx 酶活為3000～4000 u/mL，Cb酶活為10～100 u/mL，Cl 酶活為500～1000 u/mL。

采用本發(fā)明制得的纖維素酶用于酶促打漿，其打漿工藝為：紙漿為速生材硫酸鹽漿，按照本發(fā)明所述的方法制備纖維素酶并將其儲存在纖維素酶存儲罐中以備用， 將纖維素酶存儲罐中的酶液通過計量泵以3～9 u/g 的酶用量（以FPA 酶活為單位），輸送到紙漿反應池對紙漿進行預處理。

處理條件為：漿濃3%～10%、溫度40～60 ℃、pH=6～8、處理時間1～2 h，經(jīng)纖維素酶處理后的紙漿輸送到盤磨機進行打漿。

在本發(fā)明的打漿工藝中，所述速生材硫酸鹽漿為思茅松硫酸鹽漿，酶用量7 u/g（以FPA 酶活為單位），將濃10%，溫度50 ℃，pH=7.8（紙漿本身pH），處理時間1 h。

本發(fā)明的有益效果是：1. 工藝簡單， 生產(chǎn)成本低；2. 采用所要處理的紙漿為發(fā)酵碳源能夠顯著提高酶液的適應性；3. 纖維素酶的酶活高、用量少、針對性強、效果好；4. 降低打漿能耗，對纖維本身的損傷小。

具體實施方式

圖1 是本發(fā)明纖維素酶酶促打漿工藝流程示意圖。 以下結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明詳細說明。

圖1 纖維素酶酶促打漿工藝流程示意圖

實施例1

參見圖1，一種纖維素酶的制備，其使用的生產(chǎn)菌株為里氏木霉。 將里氏木霉試管斜面菌種接入液體種子發(fā)酵罐1 中進行種子發(fā)酵得到所需要的液體種子； 然后按照一定的接種量將液體種子接入纖維素酶發(fā)酵罐2，并且在一定的發(fā)酵條件下發(fā)酵，最后經(jīng)過離心分離制得所需纖維素酶酶液， 并將其儲存在纖維素酶存儲罐3 中以備用。

酶液的具體制備： 將里氏木霉試管斜面菌種接入液體種子發(fā)酵罐1 中， 種子發(fā)酵培養(yǎng)基采用1%葡萄糖、4%營養(yǎng)元素液、1%麩皮和0.1%微量元素液，在溫度30 ℃、pH=5.76、攪拌速度250 r/min、通風量0.2 m3/h 的條件下發(fā)酵48 h 得到所需要的液體種子； 然后按照2%的接種量將種子接入纖維素酶發(fā)酵罐2； 發(fā)酵培養(yǎng)基采用0.1%思茅松硫酸鹽漿、8%營養(yǎng)元素液、0.2%微量元素液、1%麩皮和加入量為0.2%的表面活性劑Tween-80，在溫度30 ℃、pH=6、攪拌速度300 r/min、通風量0.2 m3/h 的條件下發(fā)酵96 h， 然后經(jīng)過離心分離制得所需纖維素酶酶液，并將其儲存在纖維素酶存儲罐3 中以備用。 所制纖維素酶酶液的酶活分別為：FPA 酶活981.67 u/mL，Cx 酶活3083.19 u/mL，Cb 酶活為27.79 u/mL，Cl 酶活571.42 u/mL。

酶促打漿工藝：紙漿為思茅松硫酸鹽漿，將纖維素酶存儲罐3 中的酶液通過計量泵以7 u/g 的酶用量(以FPA 酶活為單位)輸送到紙漿反應池4，對紙漿進行預處理，處理條件為漿濃10%、溫度50 ℃、pH=7.8(紙漿本身pH 值)、處理時間1 h，經(jīng)纖維酶處理以后的紙漿輸送到盤磨機5 進行打漿。

實施例2

比照漿樣分別采用空白漿樣和商品纖維素酶酶促打漿漿樣。 按本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法制備空白漿樣， 即不使用本發(fā)明的纖維素酶對紙漿進行打漿。 在相同處理條件下， 采用商品纖維素酶進行酶促打漿。

按照國家紙漿物理性能檢測方法， 測定本發(fā)明打漿漿樣、 空白漿樣和商品纖維素酶打漿漿樣的物理性能，結(jié)果見表1。

表1 不同漿樣的物理性能

從表1 中可以看出， 本發(fā)明的酶處理漿樣能夠明顯降低磨漿機負荷， 從而節(jié)省磨漿能耗， 節(jié)能約25%，與商品纖維酶打漿的節(jié)能值相當，并且紙漿的物理性能沒有受到太大影響。

采用里氏木霉發(fā)酵纖維素酶進行速生材硫酸鹽漿酶促打漿，其工藝簡單、設(shè)備投資少、成本低、工藝流程緊湊，具有降低打漿能耗的效果，適合應用于我國現(xiàn)有造紙原料結(jié)構(gòu)狀況下的制漿原料的打漿工藝。