嚴(yán)新忠，洪大富, ，程 智，李 抄，周衛(wèi)斌，杜耀華

(1. 天津科技大學(xué)電子信息與自動(dòng)化學(xué)院，天津300222；2. 軍事科學(xué)院系統(tǒng)工程研究院衛(wèi)勤保障技術(shù)研究所，天津300171)

新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)具有很強(qiáng)的傳播性和致病性，該病毒作用于呼吸道或消化道上皮細(xì)胞，經(jīng)血液循環(huán)至肺部，對(duì)肺臟功能細(xì)胞進(jìn)行攻擊，最終引發(fā)病毒性肺炎[1-2].新型冠狀病毒主要通過兩種傳播方式實(shí)現(xiàn)對(duì)人員的感染[3-7]：(1)接觸傳播，即通過肢體接觸后再經(jīng)呼吸道或消化道完成傳播感染；(2)氣溶膠傳播，即病毒附著在灰塵、水汽等氣溶膠上完成傳播感染[8-9].

對(duì)確診病人進(jìn)行一些容易產(chǎn)生氣溶膠的操作會(huì)增加傳播冠狀病毒(嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒和中東呼吸綜合征冠狀病毒)的風(fēng)險(xiǎn)，例如氣管插管、無創(chuàng)通氣、氣管切開術(shù)、心肺復(fù)蘇、插管前人工通氣和支氣管鏡檢查等.

新型冠狀病毒的環(huán)境采樣為檢測分析提供了樣品保障.在隔離留觀區(qū)和隔離重癥監(jiān)護(hù)病區(qū)等區(qū)域，患者通過呼吸向周圍環(huán)境輸出新型冠狀病毒.在采集呼吸道標(biāo)本、氣管插管、氣管切開、無創(chuàng)通氣、吸痰等可能出現(xiàn)血液、體液和分泌物噴濺的處置操作區(qū)，應(yīng)著重關(guān)注冠狀病毒氣溶膠的存在情況，有效采取相關(guān)采樣手段對(duì)環(huán)境進(jìn)行采樣分析.

對(duì)感染者接觸環(huán)境的新型冠狀病毒進(jìn)行高效采樣是合理制定相關(guān)防御措施和切斷病毒傳播途徑的關(guān)鍵.本文基于傳統(tǒng)病毒采樣方法與新型冠狀病毒的物性特征，總結(jié)新型冠狀病毒的固態(tài)附著、液態(tài)攜帶和生物氣溶膠3種形式下的采樣方法.

1 新型冠狀病毒的采樣方法

新型冠狀病毒屬于β屬冠狀病毒，病毒顆粒的外形特征呈球形或橢球型，常為多形性，其粒徑為 60～140nm，通過透射電鏡對(duì)感染者呼吸道上皮超薄切片進(jìn)行表征觀察，可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外游離著新型冠狀病毒顆粒，同時(shí)在細(xì)胞質(zhì)中也觀察到囊泡膜包裹的病毒顆粒[10].新型冠狀病毒在感染者接觸環(huán)境內(nèi)的存在形式主要有固態(tài)附著形式、液態(tài)攜帶形式和生物氣溶膠形式.針對(duì)不同的存在形式，應(yīng)采取不同的采樣方法，以達(dá)到最佳采樣效果.

1.1 固態(tài)附著形式

新型冠狀病毒的固態(tài)附著形式是指新型冠狀病毒附著于固體表面的存在形式，如感染者使用過的門把手(2020年2月3日，廣州市疾控中心在一名確診患者家中門把手上發(fā)現(xiàn)新型冠狀病毒的核酸)、電梯按鈕、水杯等.

此類存在形式的新型冠狀病毒可以通過棉拭子涂抹法[11]和濾紙條粘貼法[12]進(jìn)行采樣.

棉拭子涂抹法：將無菌棉簽在含 3mL中和劑采樣液的 15mL離心管中沾濕，對(duì)檢測目標(biāo)表面約5cm×5cm區(qū)域進(jìn)行涂抹采樣，橫豎往返各8次，覆蓋整個(gè)采樣區(qū)域，采樣完成后以無菌操作方式將棉簽采樣端剪入原采樣管內(nèi).針對(duì)表面足夠且規(guī)整的目標(biāo)污染區(qū)可按該方法在表面不同位置進(jìn)行采樣，對(duì)于表面積小于 5cm×5cm 的物體(如 EP管等)采樣范圍覆蓋整個(gè)表面，對(duì)表面不規(guī)則部位(如儀器內(nèi)部部位等)采樣應(yīng)盡量覆蓋足夠面積.

濾紙條粘貼法：將滅菌濾紙條放于無菌平皿內(nèi)，加少量滅菌生理鹽水潤濕，平貼于疑似病毒污染面，1min后取下，放入50mL生理鹽水中.

1.2 液態(tài)攜帶形式

新型冠狀病毒的液態(tài)攜帶形式是指新型冠狀病毒存在于懸濁液或污水中，如感染者的唾液、痰、尿液及感染者使用過的廢水等.

針對(duì)唾液、痰等小體積液態(tài)附著物中攜帶的新型冠狀病毒可以通過棉拭子涂抹法進(jìn)行取樣，其操作步驟與固態(tài)附著形式基本相同，在此不多贅述.

液態(tài)攜帶形式的新型冠狀病毒還可以采用滴管采樣法進(jìn)行采樣，即用滴管吸取可疑液體，注入預(yù)先裝有 200μL PBS緩沖液的采樣管中，封管后完成采樣.

除此兩種方法外，針對(duì)大體積容量污水中的新型冠狀病毒采樣可以采用超濾膜富集法[13-15]，即：使用孔徑為 0.22μm的濾芯過濾，去除采樣液中的細(xì)菌等雜質(zhì)，再使用超濾膜富集可能存在的新型冠狀病毒粒子.

1.3 生物氣溶膠形式

新型冠狀病毒的生物氣溶膠形式是指新型冠狀病毒經(jīng)感染者體內(nèi)排出后附著在灰塵、水汽等微小顆粒上形成病毒型生物氣溶膠.與常規(guī)生物氣溶膠相比，病毒型生物氣溶膠具有更強(qiáng)的不穩(wěn)定性、傳播性和致病性.

相比于固態(tài)附著形式和液態(tài)攜帶形式，生物氣溶膠形式的新型冠狀病毒更容易隨著自然風(fēng)和氣流進(jìn)行擴(kuò)散，從而具有更強(qiáng)的傳播能力和致病能力.因此，對(duì)生物氣溶膠形式的新型冠狀病毒進(jìn)行采樣至關(guān)重要.

生物氣溶膠形式的新型冠狀病毒采樣方法可分為被動(dòng)采樣法和主動(dòng)采樣法[16]兩類.

1.3.1 被動(dòng)采樣法

最典型的被動(dòng)采樣法是自然沉降法[17]，該方法常用來評(píng)估微生物對(duì)檢測對(duì)象表面污染.其具體采樣過程：將直徑為 90mm 的采樣板置于離地面 1m以上(通常選擇人體呼吸帶 1.5m 位置)，距墻面 1m以上的位置上，暴露 1h以上.該方法可以用來評(píng)價(jià)大氣中微生物污染程度，從采樣結(jié)果可以得到大氣中微生物污染指數(shù)(IMA).但據(jù)研究表明，用此方法進(jìn)行采樣得到的 IMA略低于真實(shí)值，不能準(zhǔn)確地反映空氣中新型冠狀病毒的實(shí)際濃度，采樣效率較低，因此不作為傳染性病毒的主要采樣方法[18].

1.3.2 主動(dòng)采樣法

主動(dòng)采樣法是借助外力提高新型冠狀病毒采樣效率和采樣精度的采樣方法.此類方法主要有過濾法、沖擊法、撞擊法、氣旋法、靜電法、溫差迫降法和虛擬濃縮法等.

過濾法[19]是通過過濾阻留器進(jìn)行采樣，過濾阻留器通過抽氣裝置將空氣吸入采樣口，通過擴(kuò)散、慣性碰撞和吸附作用阻留新型冠狀病毒粒子，使其附著在濾膜上，從而達(dá)到采樣目的.常用的濾膜材料有硝酸纖維素酯、明膠等，濾膜濾孔一般為 0.01～10μm，采樣流量1～50L/min，采樣時(shí)間一般不超過30min.

沖擊法[20]是采用噴射氣流管使新型冠狀病毒生物氣溶膠氣流通過采樣液(如生理鹽水、PBS緩沖液等)，氣流中攜帶的病毒粒子會(huì)在采樣液的黏滯力作用下被捕獲，完成收集采樣.采用這種方法的代表性采樣器有全玻璃液體撞擊式 AGI-30型和Biosampler型采樣器，AGI-30型采樣器的采樣流量為 12.5L/min，適用于 15～30min的采樣；Biosampler型采樣器在相同的采樣流量下使用非揮發(fā)性采樣液進(jìn)行采樣，采樣時(shí)間可以達(dá)到 8h.圖 1為液體沖擊式采樣器.

圖1 液體沖擊式采樣器Fig. 1 Liquid impact bioaerosols sampler

撞擊法[21-23]是采用氣流通道使新型冠狀病毒生物氣溶膠氣流撞擊培養(yǎng)皿，在慣性和重力的作用下，新型冠狀病毒粒子會(huì)滯留在固體培養(yǎng)基上，從而達(dá)到采樣目的.此方法最具代表性的采樣器是 Anderson型六級(jí)采樣器(圖 2)，其采樣流量為 28.3L/min.這種方法的局限性在于病毒粒子經(jīng)撞擊后會(huì)有較大概率發(fā)生輕微破損，采樣時(shí)間過長還容易導(dǎo)致培養(yǎng)基脫水，以致降低生物活性.在采集過程中應(yīng)考慮新型冠狀病毒的生存方式，新型冠狀病毒需要活體細(xì)胞作為載體，因此采樣器內(nèi)的培養(yǎng)基不能采樣常規(guī)的瓊脂培養(yǎng)基，應(yīng)采用血漿凝塊培養(yǎng)基作為采集載體.采樣工作結(jié)束后對(duì)血漿凝塊進(jìn)行新型冠狀病毒核酸檢測[24].

氣旋法[25-26]是通過氣流管將新型冠狀病毒生物氣溶膠引入采樣器，在旋風(fēng)、慣性和重力等作用下，采樣杯內(nèi)的液體會(huì)潤濕采樣杯壁面，同時(shí)氣流中的新型冠狀病毒粒子會(huì)沿著壁面做向心運(yùn)動(dòng)，最終被采樣液的黏性力吸附，完成收集采樣.此方法最具代表的采樣器是法國的 Coriolis生物氣溶膠采樣器(圖 3)，其采樣流量能夠達(dá)到 300L/min，適合大流量采樣工作.

圖2 Anderson六級(jí)采樣器Fig. 2 Anderson sampler

圖3 Coriolis生物氣溶膠采樣器Fig. 3 Coriolis bioaerosols sampler

靜電法[27-28]是對(duì)既定空氣環(huán)境施加高壓靜電，使空氣中的新型冠狀病毒生物氣溶膠帶電，再用帶有相反電荷的采樣面進(jìn)行吸附.但是，此方法對(duì)新型冠狀病毒具有一定的破壞性，會(huì)影響后續(xù)檢測分析. Piri等[29]經(jīng)過大量的實(shí)驗(yàn)，證明了在放電過程中會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，該物質(zhì)會(huì)溶于采樣液中，并對(duì)采樣液中的生物氣溶膠造成破壞.

溫差迫降法[30]是利用新型冠狀病毒生物氣溶膠粒子的熱泳原理進(jìn)行采樣，采樣過程復(fù)雜，采樣環(huán)境需冷卻，因此僅適用于實(shí)驗(yàn)室.

虛擬濃縮法[31-33]是運(yùn)用離心力和慣性分離將大流量空氣中的新型冠狀病毒生物氣溶膠粒子富集到小流量中，從而完成濃縮富集.圖 4為氣溶膠富集器.此方法需結(jié)合其他采樣器進(jìn)行采樣，以提高較低濃度新型冠狀病毒生物氣溶膠的檢出率.

表 1為以上 7種主動(dòng)采樣法的優(yōu)缺點(diǎn)分析.單一的采樣方法很難準(zhǔn)確地反饋環(huán)境中真實(shí)的樣本信息，因此多方法聯(lián)合采樣可以使采樣結(jié)果更加接近真實(shí)情況.虛擬濃縮法與沖擊法聯(lián)用可以提高低濃度下新型冠狀病毒生物氣溶膠的收集效率[34]，但對(duì)于粒徑小于 1μm 的新型冠狀病毒生物氣溶膠粒子，這種方式采樣效率較低.將沖擊法與過濾法聯(lián)用，可提高不同環(huán)境下新型冠狀病毒生物氣溶膠的采樣穩(wěn)定性和敏感性，采樣效率較高[35]，因而適合采集醫(yī)療操作環(huán)境的新型冠狀病毒生物氣溶膠樣品.

圖4 氣溶膠富集器Fig. 4 Aerosol concentrator

表1 主動(dòng)采樣法的優(yōu)缺點(diǎn)分析Tab. 1 Advantages and disadvantages of active sampling method

對(duì)新型冠狀病毒生物氣溶膠的研究不局限于傳統(tǒng)的采樣-檢測-評(píng)估模式，國內(nèi)外也正在探索一些新方法，其中最具代表性的是基于激光誘導(dǎo)熒光的單粒子檢測法[36-39].該方法通過對(duì)光路整形，使新型冠狀病毒生物氣溶膠粒子逐一通過激光檢測區(qū)，經(jīng)激光誘導(dǎo)產(chǎn)生一定波長的熒光信號(hào)和散射信號(hào)，將所有粒子的熒光信號(hào)和散射信號(hào)進(jìn)行聚類分析，可判定其生物屬性和環(huán)境濃度.Gabbarini等[40]用發(fā)射266nm的紫外激光照射不同病毒，并用光譜儀記錄發(fā)射光譜.該分類技術(shù)顯示了區(qū)分病毒的可能性.此方法不僅可以實(shí)時(shí)反饋環(huán)境中熒光信號(hào)和散射信號(hào)濃度信息，還能通過機(jī)器人搭載進(jìn)行遠(yuǎn)程檢測.但機(jī)器感知、算法優(yōu)化等技術(shù)難點(diǎn)尚未完全攻克，因此還處于試驗(yàn)階段.

2 新型冠狀病毒采樣方法在不同環(huán)境下的應(yīng)用

對(duì)不同環(huán)境下存在新型冠狀病毒進(jìn)行差異性采樣可以有效提高采樣效率和采樣精度.準(zhǔn)確的采樣數(shù)據(jù)可以提高新型冠狀病毒的檢測效率，對(duì)指導(dǎo)新型冠狀病毒消殺起著至關(guān)重要的作用.

新型冠狀病毒感染者接觸過的門把手、水杯等固體表面極易殘留新型冠狀病毒，對(duì)于此類固體表面采樣建議采用棉拭子涂抹法.新型冠狀病毒感染者的唾液、尿液和其接觸過的液體環(huán)境的采樣可以采取棉拭子涂抹法和滴管采樣法.趙昊寧等[41]在對(duì)新型冠狀病毒消毒前進(jìn)行的物體表面采樣，工作人員先將患者頻繁接觸或多次接觸的物品通過棉拭子置于規(guī)格板上采樣，多次連續(xù)采樣后，去除工作人員的防護(hù)乳膠手套可能觸摸到的部分，在試管中先注入 10mL試驗(yàn)采樣液，再將樣品存入試管中，及時(shí)送檢.

自然沉降法操作簡單，使用成本低，可以被用作現(xiàn)場消殺前新型冠狀病毒采樣.趙昊寧等[41]在對(duì)新型冠狀病毒進(jìn)行現(xiàn)場消毒時(shí)，將無菌瓊脂板水平敞開靜置于空氣環(huán)境中心處的0.8～1.5m高度，瓊脂板在待消殺環(huán)境中水平靜置一段時(shí)間，將板蓋蓋好，以保證裝置內(nèi)部封閉，并在裝置上做標(biāo)號(hào)記錄，及時(shí)送檢，此處用到的采樣方法就是自然沉降法.

街道、小區(qū)和住宅等人員相對(duì)稀疏的地區(qū)，其存在新型冠狀病毒的可能性比較小，因此可以采用快速排查方式對(duì)其進(jìn)行檢測分析，如果發(fā)現(xiàn)異常，則對(duì)異常區(qū)域及附近區(qū)域進(jìn)行精確檢測，以便及時(shí)切斷傳染源.此類區(qū)域可以采用沖擊法和撞擊法進(jìn)行定點(diǎn)快速采樣，經(jīng)檢測一旦發(fā)現(xiàn)疑似新型冠狀病毒存在，應(yīng)采用虛擬濃縮法針對(duì)性地采樣篩查，排除病毒隱患.

對(duì)于超市、地鐵站等人員較為密集的場所，一旦人群中存在新型冠狀病毒感染者，后果將不堪設(shè)想.因此，對(duì)此類人員相對(duì)集中、人員流動(dòng)性較大的區(qū)域，應(yīng)采取持續(xù)采樣的實(shí)時(shí)監(jiān)測手段對(duì)環(huán)境中新型冠狀病毒的存在情況進(jìn)行準(zhǔn)確反饋.氣旋法可以對(duì)環(huán)境中的新型冠狀病毒進(jìn)行持續(xù)采樣，對(duì)應(yīng)的采樣設(shè)備輕巧便攜，適用于移動(dòng)式動(dòng)態(tài)監(jiān)控.

對(duì)于方艙醫(yī)院、隔離留觀病房、隔離病房和隔離重癥監(jiān)護(hù)室等容易產(chǎn)生新型冠狀病毒生物氣溶膠的區(qū)域，應(yīng)考慮其特殊性和重要性，著重采取多方法聯(lián)合采樣，以降低采樣誤差和提高采樣效率，減少誤檢誤報(bào)情況發(fā)生.

以上幾種典型環(huán)境下的新型冠狀病毒采樣方法總結(jié)見表2.

表2 幾種典型環(huán)境的新型冠狀病毒采樣方法Tab. 2 Several SARS-CoV-2 sampling methods for typical environments

3 展 望

新型冠狀病毒具有很強(qiáng)的傳播性和致病性，對(duì)其進(jìn)行高效快速的采樣可以提高病毒檢測效率，并對(duì)病毒消殺具有指導(dǎo)意義.常規(guī)的病毒采樣方法具有一定的局限性，多方法聯(lián)合采樣可以有效增加采樣效率和采樣精度，但同時(shí)也會(huì)增加采樣成本和采樣難度.新型冠狀病毒的研究不應(yīng)該局限于“采樣-檢測-消殺”的傳統(tǒng)模式，建議借助現(xiàn)有成熟的生物檢測、數(shù)據(jù)分析和強(qiáng)大的數(shù)據(jù)計(jì)算單元、數(shù)據(jù)傳輸技術(shù)，開發(fā)集采樣、培養(yǎng)、檢測和評(píng)價(jià)為一體的新型檢測技術(shù)與設(shè)備.另外，隨著生物檢測技術(shù)的發(fā)展和大數(shù)據(jù)產(chǎn)業(yè)興起，新的微生物檢測技術(shù)將得到發(fā)展.例如，通過對(duì)空氣中存在的目標(biāo)病原體進(jìn)行檢測分析后建立病原基因庫，一旦檢測到相應(yīng)傳染源，即自動(dòng)觸發(fā)報(bào)警，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)環(huán)境中目標(biāo)病原體的實(shí)時(shí)監(jiān)測.