郝惠文， 陶 冶， 宋慧茹， 楊 波,2， 王 毅,2， 胡 征,2

(1. 湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院， 武漢 430068； 2. 湖北工業(yè)大學(xué) 發(fā)酵工程教育部重點實驗室， 武漢 430068)

流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae，Hi)革蘭氏陰性菌[1]是兒童和成人侵襲性肺部感染的主要病因之一[2]。已知的流感嗜血桿菌定植部位是人類上呼吸道和下呼吸道[3]，莢膜菌株中b型流感嗜血桿菌[4](Haemophilusinfluenzaetype b， Hib)和無莢膜型流感嗜血桿菌(Non-typeableHaemophilusinfluenzae，NTHi)[4]能引起腦膜炎、膿毒癥、急性中耳炎、肺炎和結(jié)膜炎等疾病[5]。這顯示了Hib和NTHi菌株在臨床診斷的緊迫性與重要性[6]。 目前臨床診斷流感嗜血桿菌感染的方法主要有“金標(biāo)準(zhǔn)”培養(yǎng)法[7]、血清學(xué)檢測[8]和核酸檢測[9]。這些方法存在檢測時間過長、操作步驟復(fù)雜、成本較高等局限性。膠體金免疫層析法具有簡便、快速、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點，更適用于床旁檢測。單克隆抗體的均一、穩(wěn)定、高特異性等優(yōu)點使免疫層析技術(shù)在病原診斷領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

流感嗜血桿菌的外膜蛋白P6是一種肽聚糖相關(guān)的脂蛋白，在不同莢膜血清型以及無莢膜菌株間表現(xiàn)出高度保守性和抗原性，被認(rèn)為是檢測流感嗜血桿菌的理想目標(biāo)[10]。因此，本研究擬用單克隆抗體建立基于雙抗體夾心免疫層析技術(shù)的流感嗜血桿菌快速檢測方法。

1 材料與方法

1.1 供試材料與菌株

重組蛋白P6-His，由本實驗室構(gòu)建并表達(dá)純化[11]。8周齡的BALB/c雌性小鼠購自湖北省疾病預(yù)防控制中心。菌種：流感嗜血桿菌(H.influenzae，ATCC 49247)、肺炎鏈球菌(S.pneumoniae，ATCC 25238)、卡他莫拉菌(M.catarrhalis，ATCC 49619)、肺炎支原體(M.pneumonia，ATCC 15531)和嗜肺軍團(tuán)菌(L.pneumophila，ATCC 33152)均購自ATCC；金黃色葡萄球菌(S.aureus)、肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)、產(chǎn)酸克雷伯菌(K.oxytoca)、鮑曼不動桿菌(A.baumannii)和銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)均由湖北省武警總醫(yī)院分離鑒定。

1.2 主要設(shè)備和試劑

Protein A親和層析柱購自常州天地人和生物科技；Sephadex G25 凝膠填料購自 GE；羊抗鼠IgG購自武漢飛羿科技；亞型鑒定試劑盒購自Proteintech；Octet Red 96e分子相互作用儀購自ForteBio；硝酸纖維素膜(CN140)購自Sartorius；玻璃纖維膜(CB08)、吸水紙(CH37K)、PVC板(SM31-40)購自上海良信科技。

1.3 方法

1.3.1 單克隆抗體的制備和純化

按常規(guī)方法用P6重組蛋白免疫BALB/c小鼠3次，取SP2/0與免疫小鼠脾細(xì)胞按1∶5比例混合進(jìn)行細(xì)胞融合。分別以P6重組蛋白和滅活的Hi菌為包被抗原，經(jīng)ELISA篩選及多次亞克隆，得到穩(wěn)定目標(biāo)抗體的雜交瘤細(xì)胞株。將篩選到的陽性雜交瘤細(xì)胞注射至已提前佐劑致敏的BALB/c小鼠腹腔，10～12 d后收集腹水，用Protein A 親和層析純化腹水，純化后的抗體用紫外分光光度儀檢測濃度，SDS-PAGE分析其純度。

1.3.2 單克隆抗體的鑒定

2)Western Blot特異性鑒定。將離心收集Hi菌超聲破碎，離心后分別收集超破后的菌體上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳，以P6重組蛋白為陽性對照，轉(zhuǎn)至PVDF膜，將制備的單抗分別作為一抗孵育，以HRP標(biāo)記的羊抗鼠為二抗，通過ECL化學(xué)發(fā)光進(jìn)行顯影。

3)相互作用力檢測。采用無標(biāo)記分子相互作用儀對純化后的單克隆抗體進(jìn)行抗原抗體相互作用力檢測。將鼠免疫球蛋白定量傳感器(AMC)經(jīng)緩沖液平衡后在純化后的單克隆抗體中固化；洗去非特異性結(jié)合的雜質(zhì)后再浸入含Hi菌緩沖液中進(jìn)行結(jié)合；經(jīng)平衡后在解離緩沖溶液中解離，利用儀器的分析軟件得到動力學(xué)常數(shù)。用GraphPad Prism 7軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理生成結(jié)合解離曲線。

1.3.3 膠體金免疫層析試紙條的制備

用檸檬酸還原法制備40 nm膠體金[11]，并將抗體分別進(jìn)行膠體金的標(biāo)記及劃線，進(jìn)行組裝、斬切形成0.4 cm的試紙條，加入干燥劑密封保存。

1.3.4 免疫層析試紙性能評估

1)特異性測試。用試紙條分別檢測108CFU/mL滅活的Hi菌和其他9種呼吸道常見病原菌，鑒定試紙條的特異性。

2)靈敏性測試。用試紙條分別檢測將從1.0×109至1.0×106CFU/mL不同濃度的Hi菌，以能觀察到陽性結(jié)果的最低菌濃度作為試紙條的檢測極限。

3)穩(wěn)定性和重復(fù)性測試。將制備的3個批次的試紙條放置45 ℃儲存，分別在間隔10、25和37 d時，用適當(dāng)濃度的陽性樣本和陰性樣本檢測試紙條的穩(wěn)定性，根據(jù)公式推導(dǎo)其常溫下的保存時間。

2 結(jié)果與分析

2.1 陽性雜交瘤細(xì)胞株的篩選

對融合后的細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)7～9 d后，取其上清液通過間接ELISA測定，選取陽性數(shù)值較高的細(xì)胞株，經(jīng)3次亞克隆最終得到2株穩(wěn)定的分泌目的抗體的單克隆抗體細(xì)胞株，分別命名為Hi-1#和Hi-2#。

2.2 抗體的亞型及濃度測定

取兩種純化后的單克隆抗體，經(jīng)鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒對制備的單抗亞類進(jìn)行鑒定，其重鏈均為IgG1型，輕鏈均為Kappa型。用紫外分光光度儀測定兩種抗體總量，分別為2.1和3.2 mg，經(jīng)SDS-PAGE驗證純度在95%以上(圖1)。

M：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：Hi-1#；2：Hi-2#

2.3 單克隆抗體效價測定

表1 純化后單克隆抗體效價測定ELISA結(jié)果

2.4 抗體的特異性鑒定

通過Western Blot鑒定兩種抗P6蛋白單克隆抗體是否能與流感嗜血桿菌特異性結(jié)合(圖2)。泳道1、4中均出現(xiàn)條帶，且條帶位置與表達(dá)純化的P6-His蛋白大小一致，泳道2、3、5和6出現(xiàn)條帶位置與文獻(xiàn)報道的天然P6蛋白大小一致(約16 ku)。結(jié)果表明兩種單克隆抗體均能夠高特異性識別流感嗜血桿菌的天然P6蛋白。

2.5 抗體的親和力鑒定

由圖3和表2可知：兩種單抗分別與流感嗜血桿菌相互作用力KD值分別為10-9和10-10，有較強(qiáng)的親和力；解離速率常數(shù)(kdis)解離速率均在10-3～10-4，說明抗原抗體結(jié)合得很穩(wěn)定；R2>0.9，說明擬合曲線與實際曲線擬合度高。由此可得兩種抗體與Hi菌均有較好的親和力。

M：彩色預(yù)染蛋白；1、4：P6-His蛋白；2、5：流感嗜血桿菌超破上清；3、6：流感嗜血桿菌超破沉淀。(a)Hi-1#；(b)Hi-2#

(a)Hi-1#；(b)Hi-2#

表2 生物膜干涉技術(shù)(BLI)檢測數(shù)據(jù)結(jié)果

2.6 膠體金試紙?zhí)禺愋詼y試

制備的流感嗜血桿菌的試紙條，與Hi菌反應(yīng)為陽性，與其他9種呼吸道常見病原菌的檢測結(jié)果均為陰性，結(jié)果見圖4。這表明制備的流感嗜血桿菌檢測試紙條具有高的特異性。

圖4 流感嗜血桿菌膠體金免疫層析試紙條的特異性檢測

2.7 膠體金試紙靈敏度測試

在Hi菌的連續(xù)稀釋液中，試紙條的檢出限為1×107CFU/mL，結(jié)果見圖5。

圖5 流感嗜血桿菌膠體金免疫層析試紙條的檢測靈敏度

2.8 膠體金試紙穩(wěn)定性測試

隨著存放時間的延長，檢測線和質(zhì)控線的顏色無明顯變化，當(dāng)45 ℃存放時間達(dá)到37 d時，檢測線和質(zhì)控線均正常(圖6)，因此檢測卡可在45 ℃儲存37 d，根據(jù)經(jīng)驗公式，相當(dāng)于在常溫儲存1年。

(a)45 ℃保存10 d；(b)45 ℃保存25 d；(c)45 ℃保存37 d

3 討論與結(jié)論

研究表明無莢膜的NTHi菌株感染率逐年上升[13]，但缺乏較為簡便、快速、穩(wěn)定的檢測方法。陶冶等[11]針對P6線性抗原表位設(shè)計得到多克隆抗體膠體金免疫層析試紙，有較高的靈敏度但是多抗特異性弱且不穩(wěn)定。Zhao等[14]研究表明P6蛋白在所有H.influenzae間均有表達(dá)，其具有種屬特異性、廣譜表達(dá)性，該蛋白暴露在胞外，且具有較好的免疫原性。本研究確定以P6蛋白作為H.influenzae的檢測標(biāo)志物，采用單克隆抗體與膠體金試紙相結(jié)合，其優(yōu)點在于單克隆抗體穩(wěn)定性高且均一及特異性強(qiáng)，并且適合大規(guī)模生產(chǎn)。