祿亞洲， 張二豪， 尹 秀， 蔡 皓， 袁 雷， 李連強(qiáng)， 趙墾田， 蘭小中

(1. 西藏農(nóng)牧學(xué)院 高原生態(tài)研究所， 林芝 860000； 2. 西藏農(nóng)牧學(xué)院 西南大學(xué)藥用植物聯(lián)合研發(fā)中心， 林芝 860000； 3. 西藏農(nóng)牧學(xué)院 食品科學(xué)學(xué)院， 林芝 860000； 4. 西藏農(nóng)牧學(xué)院 資源與環(huán)境學(xué)院， 林芝 860000)

內(nèi)生菌普遍存在于各種陸生及水生植物中[1]。人們發(fā)現(xiàn)植物體內(nèi)存在大量有益的內(nèi)生細(xì)菌和內(nèi)生真菌，這些內(nèi)生菌在植物體內(nèi)能行使多種生物學(xué)功能，為植物提供生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)如氮源(內(nèi)生共生固氮)以及一些激素，能夠促進(jìn)植物快速生長，增強(qiáng)植物抗逆境、抗病害及抗動(dòng)物危害的能力[2]。

毛茛科芍藥屬的大花黃牡丹[Paeonialudlowii(Stern & G.Taylor) D.Y.Hong]為西藏特有瀕危植物，其花大且色艷，擁有芍藥屬其他植物少有的黃色花基因[3]，根中含有丹皮酚，具有重要的藥用價(jià)值。根皮的揮發(fā)油及其主要成分丹皮酚可以顯著抑制人肺癌 A549 細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo) A549 細(xì)胞的凋亡，對(duì)斷發(fā)毛癬菌、絮狀表皮癬菌、石膏樣小孢子菌3種皮膚癬菌均有抑制作用，且根皮揮發(fā)油的抑菌作用略高于丹皮酚[4]。大花黃牡丹生存條件極為苛刻[3]，為叢生灌木[5]，屬國家二級(jí)瀕危植物，喜溫和氣候，較耐寒，抗旱能力較弱，分布在西藏林芝市巴宜區(qū)至米林縣長約100 km的開闊河谷地帶，垂直分布范圍為海拔2 500～3 500 m[6]。目前，有關(guān)大花黃牡丹的研究主要集中在分類學(xué)[7]、生態(tài)學(xué)[8]、栽培學(xué)[6]、孢粉學(xué)[9]、病理學(xué)[10]、生理學(xué)[11]和形態(tài)學(xué)[12]等方面，而其內(nèi)生菌方面的研究鮮有報(bào)道[13]。本研究利用高通量測(cè)序分析法，研究西藏林芝縣米瑞鄉(xiāng)大花黃牡丹植株不同組織器官及其根際土壤中真菌群落結(jié)構(gòu)和大花黃牡丹內(nèi)生真菌及其根際土壤中真菌群體的多樣性特征，以期為揭示大花黃牡丹植物內(nèi)生真菌多樣性特征及其內(nèi)生真菌的開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及消毒

大花黃牡丹植物組織及根際土壤均采集于西藏林芝市林芝縣米瑞鄉(xiāng)(29°32′43.96″N，94°38′33.03″E)，大花黃牡丹果期采集樣本(2018年6月5日)，植物不同組織樣品(根、莖、葉、花和果實(shí))均隨機(jī)采取10株植物組織并混勻，每組3個(gè)重復(fù)，將采集的樣品置于無菌袋中低溫保存帶回實(shí)驗(yàn)室，12 h內(nèi)處理。將帶回實(shí)驗(yàn)室的大花黃牡丹植物組織樣品先用無菌水沖洗6次，直至樣品清洗干凈，然后用75%體積分?jǐn)?shù)的酒精消毒30 s，再用10%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的NaClO消毒5 min，無菌水反復(fù)洗滌3次，消毒處理后的樣品-80 ℃保存。為了檢測(cè)消毒效果，取消毒處理后最后一次沖洗的無菌水涂布于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(TSA固體培養(yǎng)基)上，觀察是否有菌落生成。隨機(jī)采集10株大花黃牡丹不同深度根際土壤(上層0～10 cm，中層10～20 cm，下層20～30 cm)樣品，同層隨機(jī)混合并裝入無菌袋中，每組3個(gè)重復(fù)，低溫保存帶回實(shí)驗(yàn)室，隨后利用2 mm孔徑篩子進(jìn)行篩土，以除去毛根等植物殘?bào)w，裝入無菌袋中-20 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1 總DNA提取

根據(jù)參考文獻(xiàn)[14]的方法，使用DNeasy Plant Mini Kit(Qiagen, Germantown, MD, USA)提取植物組織及新鮮土壤樣品DNA，然后用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA提取質(zhì)量，并用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的濃度。

1.2.2 PCR擴(kuò)增

利用ITS1-F和ITS4-R引物對(duì)真菌rDNA的ITS區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增[15]，引物由武漢華大公司合成。PCR擴(kuò)增采用20 μL反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 2 μL，5 mmol/L dNTPs 1 μL，5 μmol/L IST1-F引物1 μL，5 μmol/L IST4-R引物1 μL，rTaqPolymerase 0.2 μL，Template DNA 1 μL，補(bǔ)ddH2O至20 μL。PCR擴(kuò)增條件如下：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并純化PCR產(chǎn)物，將純化后的PCR產(chǎn)物送至武漢華大測(cè)序，Illumina測(cè)序結(jié)果上傳至NCBI，排除171條低相似度的OTUs序列，其余625條OTUs序列獲得注冊(cè)號(hào)MK983532-MK984156。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析與處理

測(cè)序所得的原始數(shù)據(jù)經(jīng)數(shù)據(jù)過濾排除干擾數(shù)據(jù)，將獲得的高質(zhì)量數(shù)據(jù)拼接成Tags。利用UPARSE在97%相似度將Tags序列進(jìn)行OTU聚類，然后通過OTU與NCBI數(shù)據(jù)庫比對(duì)，對(duì)OTU進(jìn)行物種注釋[16]。利用QIIME 軟件對(duì)單個(gè)樣品進(jìn)行Alpha多樣性分析，包括Sobs(richness)、Simpsoneven、Shannon指數(shù)以及Simpson指數(shù)等[17]。Sobs(richness)值越大，說明樣品中的物種越豐富，Simpsoneven值越大，說明樣品中物種均勻度越高， Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)反映物種群落多樣性。利用QIIME(v1.80)軟件進(jìn)行物種進(jìn)化分析和Beta多樣性分析，用Bray-Curtis、weighted UniFrac、unweighted UniFrac指數(shù)來衡量Beta多樣性[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 大花黃牡丹植物組織內(nèi)生真菌及根際土壤真菌序列和多樣性分析

采用真菌rDNA高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)大花黃牡丹組織內(nèi)生真菌及根際土壤真菌多樣性進(jìn)行分析。結(jié)果表明，大花黃牡丹根、莖、葉、花和果實(shí)中有效的內(nèi)生真菌序列分別為15 182、15 291、15 257、15 244和15 265，所形成的OTU數(shù)分別為228、55、70、110和69(表1)。結(jié)果表明根部OTU個(gè)數(shù)最多，而莖中的OTU個(gè)數(shù)最少。不同深度根際土壤的有效真菌序列分別為14 891、14 994和15 042，OTUs個(gè)數(shù)分別為421、319和258。結(jié)果表明有效的根際土壤真菌序列數(shù)隨土壤深度的增加而逐漸增加，但形成的OTUs個(gè)數(shù)逐漸減少。Alpha多樣性分析表明，而果實(shí)中物種均勻度最高，根際上層土壤中真菌豐富度、均勻度和多樣性高于中層和下層土壤(表1)。

表1大花黃牡丹植物組織內(nèi)生真菌及根際土壤真菌群落組成和多樣性

(a)大花黃牡丹不同組織內(nèi)生真菌及土壤真菌稀釋曲線；(b)不同植物組織內(nèi)生真菌韋恩圖；(c)不同深度根際土壤真菌韋恩圖

稀釋曲線分析結(jié)果表明所測(cè)樣品足以覆蓋所有類群。如圖1(a)所示，隨著測(cè)序深度的增加，所有樣品曲線趨于平緩。韋恩圖分析結(jié)果表明大花黃牡丹不同植物組織中共有5個(gè)相同的OTUs，根部特有內(nèi)生真菌OTUs個(gè)數(shù)最多，198個(gè)，花中次之，57個(gè)[(圖1(b)]。而不同深度的根際土壤共有135個(gè)OTUs，根際土壤特有OTUs個(gè)數(shù)隨著土壤深度的增加而逐漸減少，分別為185、62和48個(gè)OTUs[圖1(c)]。

2.2 大花黃牡丹不同植物組織及土壤樣品中真菌群落結(jié)構(gòu)組成

2.2.1 在門、綱水平上大花黃牡丹不同樣品中真菌群落組成

對(duì)獲得的大花黃牡丹不同組織內(nèi)生真菌及根際土壤真菌的796個(gè)OTUs進(jìn)行注釋分類，結(jié)果表明不同植物組織中76 239個(gè)序列隸屬于6門13綱(圖2)。子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)是優(yōu)勢(shì)菌門，相對(duì)豐度分別為63.80%～85.30%和10.40%～36.20%。果實(shí)、花、葉中僅有2個(gè)門，即子囊菌門(Ascomycota)和擔(dān)子菌門(Basidiomycota)；莖中有3個(gè)門，分別為子囊菌門(Ascomycota，72.20%)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota，27.00%)和被孢霉門(Mortierellomycota，0.70%)；根中有6個(gè)門，其中3個(gè)門的相對(duì)豐度≥1%，分別為子囊菌門(Ascomycota，84.50%)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota，10.40%)和被孢霉門(Mortierellomycota，2.40%)[圖2(a)]。在綱水平上隸屬13綱，其相對(duì)豐度≥1%，有10個(gè)綱。根部分布的綱最多，隸屬9綱，其次是莖和葉，隸屬7綱；花和果實(shí)最少，隸屬6綱。圓盤菌綱(Orbiliomycetes)、盤菌綱(Pezizomycetes)和Rozellomycotina是根部特有綱，而傘菌綱(Agaricomycetes)是果實(shí)、花、莖和葉特有綱[圖2(b)]。

(a)門水平真菌群落組成;(b)綱水平真菌群落組成

不同深度根際土壤真菌中44 927個(gè)序列隸屬于7門11綱。子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)是優(yōu)勢(shì)菌門，相對(duì)豐度分別為38.38%～55.70%和22.3%～38.77%；其次是被孢霉門(Mortierellomycota)，相對(duì)豐度分別為14.24%～19.76%。在綱水平上隸屬13綱，其相對(duì)豐度≥1%有6綱，分別為Agaricomycetes、Dothideomycetes、Leotiomycetes、Mortierellomycetes、Sordariomycetes 和Tremellomycetes?；乇P菌綱(Orbiliomycetes)是上層土壤特有綱，其相對(duì)豐度為0.01%。

2.2.2 不同大花黃牡丹樣品中真菌群落在科、屬水平上的組成

物種熱圖(圖3和圖4)分析表明，大花黃牡丹不同組織內(nèi)生真菌被聚類為49科，每科在不同組織中的相對(duì)豐度存在顯著差異。在相對(duì)豐度≥1%條件下，果實(shí)中內(nèi)生真菌有15個(gè)科，其中:Cladosporiaceae、Filobasidiaceae和Mrakiaceae是優(yōu)勢(shì)科，其相對(duì)豐度分別為24.46%、16.00%和10.45%；根部有10個(gè)科，Herpotrichiellaceae和Helotiales是優(yōu)勢(shì)科，相對(duì)豐度分別為22.26%和15.56%；花中13個(gè)科，莖中11個(gè)科，葉中9個(gè)科，花、莖、葉中的優(yōu)勢(shì)科均為Cladosporiaceae，其相對(duì)豐度分別為36.66%、34.62%和63.09%。大花黃牡丹內(nèi)生真菌在屬水平上隸屬于67個(gè)屬，屬水平物種豐度熱圖分析結(jié)果表明，不同組織樣品中物種豐度均不相同，根中的優(yōu)勢(shì)屬是Leptodontidium(13.11%)，莖、葉、花及果實(shí)中的優(yōu)勢(shì)屬是Rachicladosporium，其相對(duì)豐度分別為28.53%、59.45%、19.77%和12.35%(圖4)。

聚類表示所有物種在不同樣品間表達(dá)的相似情況，熱圖顏色由紅到綠表示物種相對(duì)豐度從低到高；下同

不同深度根際土壤真菌群落組成和分布相似，上、中、下層根際土壤的優(yōu)勢(shì)科是Nectriaceae(16.06%～30.89%)，Hygrophoraceae(15.45%～23.05%)、Mortierellaceae(14.24%～19.74%)；其優(yōu)勢(shì)屬是濕傘屬(Hygrocybe)和被孢霉屬(Mortierella)，其相對(duì)豐度分別為14.44%～22.48%和14.24%～19.74%(圖3和圖4)。無論在科水平上還是在屬水平上，物種聚類熱圖結(jié)果表明根部內(nèi)生真菌與根際土壤真菌群落組成存在相似性，均被聚類為1組，共有29科32屬(圖3和圖4)。

2.3 大花黃牡丹不同樣品間真菌多樣性比較分析

為了分析大花黃牡丹不同樣品間真菌多樣性差異，本研究通過Beta多樣性的PCoA (principal coordinate analysis)和 CLC(complete linkage clustering)的分析來闡明不同樣品間多樣性差異。如圖5(a)所示，所有樣品被聚類為兩個(gè)類群(類群1和2)，類群1包括莖、葉、花和果實(shí)，類群2包括所有不同深度根際土壤樣品和根，結(jié)果表明不同樣品間差異較大，PC1值為32.26%，PC2值為18.66%。CLC分析結(jié)果與PCoA分析結(jié)果[圖5(b)]相似，所有樣品聚類成兩個(gè)類群，類群1(Group 1)包括果實(shí)、花、莖和葉，類群2(Group 2)包括不同深度根際土壤樣品和根。

圖4 屬水平上物種熱圖Figure 4 The analysis of heatmap at the genus level across all sample types

A：基于真菌OTUs相對(duì)分度的PCoA分析，T代表植物組織，S代表土壤；B：基于加權(quán)UniFrac 的CLC分析

2.4 Biomarker 分析

為了進(jìn)一步鑒定不同樣品間的顯著性差異和主要貢獻(xiàn)的生物類群，本實(shí)驗(yàn)采用微生物組間差異分析(Linear discriminant analysis effect size, LEfSe)[18]檢驗(yàn)不同樣品間的顯著貢獻(xiàn)關(guān)系。結(jié)果表明，根際土壤樣品與植物組織間具有差異顯著的生物標(biāo)記。在綱水平上，座囊菌綱(Dothideomycetes)是植物組織中的標(biāo)志類群，根際土壤中的標(biāo)志類群是子囊菌綱 (Sordariomycetes)和傘菌綱(Agaricomycetes)；在科水平上，植物組織中的標(biāo)志類群是Mycosphaerellaceae和Cladosporiaceae，土壤中的標(biāo)志性類群是Nectriaceae(圖6)。

以進(jìn)化分支圖(cladogram)表示，T代表植物組織，S代表土壤

3 結(jié)論

大花黃牡丹不同組織內(nèi)生真菌群落豐富度和多樣性不同，而不同深度土壤中的真菌具有相似的豐富度與多樣性。在植物組織中，根部內(nèi)生真菌物種的豐富度和多樣性最高，植物組織內(nèi)生真菌與根際土壤真菌存在不同程度上重疊，且根部內(nèi)生真菌與根際土壤真菌群落組成最為相似，說明根部內(nèi)生真菌部分可能來自根際土壤。座囊菌綱和子囊菌綱作為大花黃牡丹組織和根際土壤的標(biāo)志類群，且座囊菌綱和子囊菌綱具有一定重要的藥用價(jià)值，因此內(nèi)生真菌與大花黃牡丹的藥用功能可能存在一定的關(guān)聯(lián)性。因此研究大花黃牡丹內(nèi)生真菌及根際真菌群落之間的內(nèi)在聯(lián)系，對(duì)大花黃牡丹藥用價(jià)值和促進(jìn)其種子萌發(fā)真菌的進(jìn)一步研究具有重要意義。