袁發(fā)滸，劉 麗，巴瑞琪，陳江源，黃麗霞，朱書秀

（江漢大學 醫(yī)學院，湖北 武漢 430056）

新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID?19），是一種由嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS?CoV?2）感染導(dǎo)致的急性呼吸道傳染?。?］。自2019 年12 月在湖北武漢爆發(fā)以來，截至目前，我國已累計報告確診病例超過8 萬例［2］。此次疫情流行嚴重影響了人民生命安全，在當下缺乏疫苗的情況下，如何保護易感人群值得深入探索。

從中醫(yī)角度看，新型冠狀病毒肺炎屬于“疫”病范疇，病因為感受“疫癘”之氣［3］。本次疫情暴發(fā)以來，我國各地中醫(yī)藥工作者根據(jù)疾病情況，提出并運用了許多行之有效的防治方案，國家衛(wèi)健委發(fā)布的新型冠狀病毒防控指南中也推薦在醫(yī)學觀察期使用蓮花清瘟膠囊、疏風解毒顆粒等中成藥［4］。金葉敗毒顆粒由金銀花、魚腥草、大青葉、蒲公英組成。方中金銀花為君藥，魚腥草為臣藥。全方配伍，共奏清熱解毒、涼散透達之功［5］。

中藥方劑研究長期以來一直采用化學藥物的研究方法，將中藥化學成分的分離與活性化合物的簡單篩選相結(jié)合來研究其作用機理。雖然這種方法可以發(fā)現(xiàn)一些藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機理，但由于中藥處方的多組分特點，單一化學成分很難解釋中醫(yī)的整體作用機制［6?7］。網(wǎng)絡(luò)藥理學是近年來生物信息學與藥理學相結(jié)合而發(fā)展起來的一門新興學科，通過建立一個藥用化學成分數(shù)據(jù)庫，研究人員現(xiàn)在可以找到中藥有效成分和其作用靶標，以及疾病靶點之間的相互關(guān)聯(lián)，并將這些數(shù)據(jù)構(gòu)建為網(wǎng)絡(luò)關(guān)系模型，系統(tǒng)地解釋了藥物（藥方）在疾病治療中的作用［8］。為對金葉敗毒顆粒在COVID?19 防治中的臨床應(yīng)用提供更多依據(jù)，本研究擬利用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法，探索金葉敗毒顆粒的核心化學成分、靶點和作用途徑，進而運用分析軟件對化合物?靶點進行分子對接以及代謝通路分析等，為后期的深入研究提供參考。

1 方法

1.1 金葉敗毒顆?；钚猿煞趾Y選

將金葉敗毒顆粒中4 種藥材的拉丁名分別輸入中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Tradi?tional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）、中藥分子機制的生物信息學分析工具（Bioinformatics Analysis Tool for Molecular Mechanism of Tradi?tional Chinese Medicine，BATMAN?TCM）進行藥物活性成分查詢?？诜锢枚龋╫ral bio?availability，OB）是決定口服藥物能否克服腸上皮、腸壁等多種障礙到達靶位的重要指標。OB 較差的藥物進入血流的效率可能相對較低，因此，治療效果可能較差。為了區(qū)分藥物活性成分和非藥物活性成分，一般采用量子力學推導(dǎo)的分子物理和分配特性來計算藥物類似度（drug?like?ness，DL）指數(shù)，DL 指數(shù)可以用于評估研究藥物中化學物質(zhì)的吸收、分布、代謝和排泄特性。本研究以DL 值（≥ 0.18）和OB 值（≥ 30%）作為篩選藥物活性分子的參數(shù)，并進一步得到活性化合物對應(yīng)的靶標蛋白信息。

1.2 COVID-19 相關(guān)蛋白靶標篩選

使用關(guān)鍵詞“冠狀病毒（coronavirus）”“呼吸窘迫綜合征（respiratory distress syndrome，RDS）”“嚴重急性呼吸綜合征（severe acute respiratory syndrome，SARS）”從以下3 個數(shù)據(jù)庫中獲得可能與 COVID?19 相關(guān)的靶標：① UniProt（https：∥www.uniprot.org/）；② 在線孟德爾遺傳（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）（http：∥omim.org/）；③GeneCards（https：∥www.genecards.org/）。

1.3 藥物-化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

為了更好地展示金葉敗毒顆粒在COVID?19 治療中的作用機制，通過使用開源軟件Cyto?scape（版本 3.7.1，https：∥cytoscape.org/download.html）構(gòu)建了藥物?化合物?靶點網(wǎng)絡(luò)。Cyto?scape 是一個開源軟件平臺，可以圖形化地顯示、分析和編輯網(wǎng)絡(luò)。該軟件通常使用生物信息學來分析分子和蛋白質(zhì)之間的相互作用以及蛋白質(zhì)的生物途徑。此外，該軟件還包含大量的網(wǎng)絡(luò)分析插件，可以幫助分析多組件和多目標之間的關(guān)系，并可以獲取網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點。因此，它可以幫助識別中醫(yī)治療不同疾病的主要機制。

1.4 靶點蛋白間相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用 String 在線數(shù)據(jù)庫（https：∥string?db.org/）對靶點基因的蛋白間相互作用（protein pro?tein interaction，PPI）進行分析，以相互作用評分（interaction score）設(shè)置為最高置信度值（0.900），刪除所有自作用蛋白的數(shù)據(jù)，直觀、簡潔地顯示PPI 網(wǎng)絡(luò)。利用PPI 關(guān)聯(lián)的Reactome 數(shù)據(jù)庫進行通路分析，Reactome 是一個開放的有關(guān)于人體內(nèi) pathways、sub?pathways 及 reactions（Pathway steps）等生物過程的精選數(shù)據(jù)庫。Reactome 數(shù)據(jù)模型的核心單位是反應(yīng)（reaction）。參與反應(yīng)的實體（核酸、蛋白質(zhì)、復(fù)合物和小分子）形成生物相互作用的網(wǎng)絡(luò)，并被分組成通路。Reactome 中的生物途徑的實例包括信號傳導(dǎo)、先天和獲得性免疫功能、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、翻譯、凋亡和經(jīng)典的中間代謝等。

1.5 靶點基因生物信息學分析

在細胞生物學活動中，某些蛋白具有相同或類似的功能，它們之間存在著密切的關(guān)系，可以認為它們是一個簇（cluster），同一簇蛋白通常在疾病進展中起著協(xié)同作用。通過R 語言包clus?terProfiler 進行基因本體（gene ontology，GO）注釋和基于京都基因與基因組百科全書（Kyoto En?cyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）的通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 活性化合物篩選結(jié)果

通過 TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索后，符合篩選條件OB ≥ 30%、DL ≥ 0.18 的化合物共有31 個，其中金銀花含有23 個，魚腥草含有7 個，大青葉含有10 個，蒲公英含有7 個。進一步與COVID?19相關(guān)靶基因關(guān)聯(lián)后，共得到27 個有效化合物，見表1。其中金銀花含有16 個，魚腥草含有5 個，大青葉含有6 個，蒲公英含有4 個。

表1 金葉敗毒顆粒中COVID-19 相關(guān)活性化合物Tab.1 Active compounds related to COVID-19 in Jinyebaidu Particles

2.2 藥理網(wǎng)絡(luò)

建立金葉敗毒顆粒藥材有效成分?COVID?19 靶點的藥理網(wǎng)絡(luò)見圖1?；衔?靶點藥理網(wǎng)絡(luò)總共包括137 個節(jié)點（27 個化合物節(jié)點、110 個靶點節(jié)點）和235 條關(guān)聯(lián)線。網(wǎng)絡(luò)中，藍色箭頭標記COVID?19 靶點基因，呈環(huán)形分布。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)的拓撲學性質(zhì)篩選等級值（degree）較大的節(jié)點進行分析，這些連接化合物或靶點較多的節(jié)點在整個網(wǎng)絡(luò)中起到樞紐的作用，排名前5 位的化合物分別是MOL000098?槲皮素、MOL000006?木樨草、MOL000422?山柰酚、MOL002773?β?胡蘿卜素、MOL002309?靛玉紅。排名前 5 位的靶點基因是 PTGS2、AR、PRSS1、ESR1、PPARG。

圖1 金葉敗毒顆粒活性化合物-COVID-19 靶點網(wǎng)絡(luò)Fig.1 Interaction network between ingredients in Jinyebaidu Particles and COVID-19 related genes

2.3 靶點 PPI 網(wǎng)絡(luò)分析

在String 在線數(shù)據(jù)平臺上輸入110 個COVID?19 靶點，除去獨立于網(wǎng)絡(luò)外的節(jié)點后得到如圖2 所示的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。PPI 網(wǎng)絡(luò)中共有110 個節(jié)點蛋白，315 條作用連線，PPI 富集度P< 1.0E?16。生物相互作用通路數(shù)據(jù)庫（Reactome Pathways）分析表明該PPI 主要富集了白介素信號通路（HSA?449147 signaling by interleukins）、免疫系統(tǒng)中的細胞因子信號通路（HSA?1280215 cyto?kine signaling in immune system）、信號傳導(dǎo)通路（HSA?162582 signal transduction）、酪氨酸激酶受體信號通路（HSA?9006934 signaling by receptor tyrosine kinase）、RUNX2 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)通路（HSA?8878166 Transcriptional regulation by RUNX2）等。

2.4 GO 注釋

對金葉敗毒顆?；钚曰衔?COVID?19 靶點進行GO 注釋，富集分析得到GO 條目2 138 項（P< 0.05），其中生物過程（biological process）1 947 項、細胞組成（cellular component）54 項、分子功能（molecular function）137 項。各列出3 類GO 條目前20 條注釋（見表2）。生物學過程中主要包含營養(yǎng)水平應(yīng)答（GO：0031667）、脂多糖應(yīng)答（GO：0032496）、細胞對外界刺激應(yīng)答（GO：0071496）、細菌源性分子應(yīng)答（GO：0002237）、活性氧簇反應(yīng)（GO：0000302）等。細胞組成中主要富集條目為膜脂筏（GO：0045121）、膜微結(jié)構(gòu)域（GO：0098857）、膜區(qū)（GO：0098589）、膜小窩（GO：0005901）、囊腔（GO：0031983）等。分子功能富集條目中主要包含細胞因子受體結(jié)合（GO：0005126）、磷酸酶綁定（GO：0019902）、受體配體活性（GO：0048018）、細胞因子活性（GO：0005125）、激素受體結(jié)合（GO：0051427）等。

圖2 金葉敗毒顆?；钚曰衔?COVID-19 靶點PPIFig.2 Protein-protein interaction network between ingredients in Jinyebaidu Particles and COVID-19 related genes

表2 金葉敗毒顆粒活性化合物-COVID-19 靶點的GO 注釋Tab.2 GO terms of ingredients in Jinyebaidu Particles related to COVID-19

續(xù)表2

續(xù)表2

2.5 KEGG 通路分析

通過R 語言包clusterProfiler 對110 個靶蛋白進行KEGG 富集分析，富集分析得到KEGG 信號通路134 條（P< 0.05），根據(jù)富集評分列出前20 項通路并進行圖形化展示，得到KEGG 通路柱狀圖見圖3。主要富集的通路有晚期糖基化終產(chǎn)物配體?受體（AGE?RAGE）信號通路、流體剪切力與動脈粥樣硬化通路、膀胱癌、腫瘤壞死因子信號通路、前列腺癌、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、內(nèi)分泌抵抗、胰腺癌、甲型流感、白介素17 信號通路、人巨細胞病毒感染、癌癥中的蛋白聚糖、美洲錐蟲病、結(jié)直腸癌、松弛素信號通路、丙型肝炎病毒、麻疹、乙型肝炎病毒、C 型凝集素受體信號通路、人類親T 細胞病毒1 感染等。

圖3 金葉敗毒顆粒活性化合物-COVID-19 靶點的KEGG 通路富集Fig.3 KEGG terms of ingredients in Jinyebaidu Particles related to COVID-19

3 討論

自COVID?19 疫情發(fā)生以來，中醫(yī)藥起到了積極的防治作用。本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法，通過整合靶標預(yù)測、藥理網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和生物信息學模塊分析預(yù)測了金葉敗毒顆粒對COVID?19的潛在作用機制。金葉敗毒顆粒中的槲皮素、木樨草素、山柰酚可能是對COVID?19 起主要作用的成分，其藥理機制主要涉及到白介素信號通路、TNF 信號通路等炎性相關(guān)途徑，抗氧化應(yīng)激通路以及病毒感染相關(guān)途徑。

目前認為，肺部的炎性細胞因子風暴可能是導(dǎo)致COVID?19 病情快速進展的主要原因［9?10，4］，金葉敗毒顆粒中的相關(guān)活性分子可能在相關(guān)機制中發(fā)揮作用。Wang 等［11］發(fā)現(xiàn)，槲皮素可抑制細胞凋亡并減少炎癥細胞因子白介素6（interleukin?6，IL?6）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor?α，TNF?α）的產(chǎn)生，減輕脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）引起的 WI?38 肺成纖維細胞的炎癥損傷。Al?Rasheed 等［12］通過注射亞硝酸鈉建立大鼠肺缺氧損傷模型，發(fā)現(xiàn)槲皮素和/或褪黑激素可通過下調(diào)免疫炎癥介質(zhì)和熱休克蛋白表達來保護缺氧肺組織。和槲皮素類似，Liu等［13］發(fā)現(xiàn)，木犀草素以劑量依賴的方式通過下調(diào)miR?132 減輕LPS 誘導(dǎo)的核因子?κB（nuclear factor?κB，NF?κB）信號通路的激活，減輕了LPS 誘導(dǎo)的 BEAS?2B 細胞（人肺上皮細胞）活力喪失、炎性細胞因子表達及凋亡。在一項對62 例新型冠狀病毒肺炎患者的實驗室指標分析研究中發(fā)現(xiàn)，危重型患者血小板指標顯著降低［14］。靛玉紅可通過激活細胞血小板生成素受體，促使TNF 表達正?；瘉硪种圃l(fā)性免疫性血小板減少癥的炎癥，從而在血小板生成中起直接作用［15］。

急性呼吸窘迫往往導(dǎo)致肺組織處于低氧環(huán)境，誘導(dǎo)活性氧的增加，造成肺組織氧化損傷并進一步加劇炎性損傷［16］。低氧誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子家族（hypoxia?inducible transcription factors，HIFs）對維持組織內(nèi)的氧穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，HIFs 由一個持續(xù)表達的HIF?1β 亞基以及受組織內(nèi)氧水平嚴格調(diào)控的 HIF?α 亞基（HIF?1α 和 HIF?2α）組成。肺組織缺氧時，HIF?1α 誘發(fā)大量的促炎細胞因子表達［17］，如腫瘤壞死因子 α（tumor necrosis factor?α，TNF?α）和白介素 1β（interleukin?1β，IL?1β），并通過氧敏感的核因子?κB（nuclear factor?κB，NF?κB）進一步加劇炎癥反應(yīng)［18］。本研究 KEGG 通路分析發(fā)現(xiàn)，HIF?1 信號通路（hsa04066 HIF?1 signaling pathway，P= 5.69E?12）在金葉敗毒顆粒治療COVID?19 中可能發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法對金葉敗毒顆粒治療COVID?19 的作用機制做了初步預(yù)測，分析了該方發(fā)揮藥效的主要藥效物質(zhì)，初步探索了金葉敗毒顆粒抗COVID?19 的生物學機制，為后續(xù)臨床用藥提供了一定的參考，但仍需臨床試驗進一步驗證其確切療效。