平秋婷

(廣東省科學(xué)院生物工程研究所，廣州 510316)

亞硝酸鈉俗稱(chēng)亞硝酸鹽，是一種由亞硝酸根離子與鈉離子合成的無(wú)機(jī)鹽，主要應(yīng)用于食品中，具有護(hù)色劑功能，保障食物的顏色鮮艷，雖然這種食品添加劑具有一定的優(yōu)點(diǎn)，但是其與食品共同進(jìn)入人體會(huì)與人體中的蛋白質(zhì)等有機(jī)物質(zhì)產(chǎn)生反應(yīng)生成致癌物質(zhì)，甚至?xí)⑷梭w內(nèi)的正常血紅蛋白氧化為缺乏輸氧功能的高鐵血紅蛋白，為食品消費(fèi)者帶來(lái)巨大的安全隱患。為此，如何快速、精準(zhǔn)地測(cè)定食品中亞硝酸鈉含量已經(jīng)成為人們的重要研究課題。

文獻(xiàn)[1]中采用色譜法對(duì)食品中的亞硝酸鈉含量進(jìn)行測(cè)定，對(duì)食品中的亞硝酸鹽類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行離子色譜、氣相色譜和高效液相色譜法的含量測(cè)定；文獻(xiàn)[2]中應(yīng)用電化學(xué)分析法，將食品物質(zhì)溶入到液體化學(xué)電池中，通過(guò)判斷電解池中的電位差或電流強(qiáng)度來(lái)判定食品中亞硝酸鈉含量。

本文主要研究應(yīng)用改良法分光光度計(jì)測(cè)定食物中的亞硝酸鈉含量，并依據(jù)GB 5009.33-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定》中第二法分光光度法(鹽酸萘乙二胺法)整理本文方法下的相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，驗(yàn)證本文方法的快速有效性。

1 材料與方法

1.1 材料

分光光度計(jì)、電子天平、量筒、燒杯、玻璃棒、漏斗、擦鏡紙、肉類(lèi)食品、酒精燈、溫度計(jì)、氨基苯磺酸溶液、鹽酸萘乙二胺溶液、重鉻酸鉀、橘紅G、硫酸、蒸餾水、重氮鹽等。

1.2 方法

本文應(yīng)用肉類(lèi)食品作為測(cè)定方法的樣品，將肉類(lèi)食品進(jìn)行蛋白質(zhì)剔除與脂肪剔除，在酸性環(huán)境中投入亞硝酸鈉，亞硝酸鈉與酸性環(huán)境中物質(zhì)融合后再次向酸性環(huán)境中加入重氮鹽與鹽酸萘乙二胺，生成一種能夠被分光光度計(jì)識(shí)別的623 mm波長(zhǎng)的可吸收光波[3-4]。

方法的實(shí)現(xiàn)過(guò)程：

(1)需要將肉類(lèi)食品打磨成肉泥狀物質(zhì)，利用電子天平精準(zhǔn)提取10 g樣品；

(2)再將樣品置于50 mL的燒杯中，用玻璃棒持續(xù)攪拌2 min左右，向燒杯內(nèi)加入飽和狀態(tài)下的蒸餾水；

(3)再次用玻璃棒攪拌2 min左右，應(yīng)用酒精燈對(duì)燒杯進(jìn)行加熱，當(dāng)燒杯中樣品溫度達(dá)到80 ℃停止加熱，將燒杯中樣品轉(zhuǎn)入量筒中并進(jìn)行搖勻；

(4)再次將量筒中的樣品進(jìn)行水浴加熱至70 ℃，最后用冷水浴的方式使樣品溫度降低到常溫，獲取肉類(lèi)食品的待測(cè)定食品提取液。

由于只經(jīng)過(guò)加熱處理后的待測(cè)定樣品中會(huì)存在一些易發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的其他有機(jī)物質(zhì)，所以本文將在常溫化的樣品提取液中加入3 mL亞鐵氰化鉀溶液，再加入50 mL蒸餾水進(jìn)行樣品定容并搖勻，使樣品提取液靜置止1 h，容易產(chǎn)生化學(xué)變化或干擾分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定的物質(zhì)沉淀在量筒底部，溶液上層澄清的液體主要為蒸餾水以及其他濾液，不包含本次實(shí)驗(yàn)測(cè)定的亞硝酸鈉物質(zhì)與肉類(lèi)食品含量，樣品提取與凈化流程圖見(jiàn)圖1。

圖1 樣品提取與凈化流程圖Fig.1 The flow chart of sample extraction and purification

實(shí)驗(yàn)中還制定亞硝酸鈉的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用電子天平精準(zhǔn)量取0.2 g亞硝酸鈉，在干燥常溫的環(huán)境中制取亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液，為了防止亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液在空氣中氧化而干擾分光光度計(jì)對(duì)亞硝酸鈉的測(cè)定結(jié)果，需要在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行過(guò)程中對(duì)亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行現(xiàn)用現(xiàn)配[5-6]。將配制好的亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液放置在經(jīng)過(guò)改良法改良后的分光光度計(jì)比色管中，并在比色管中添加一定量的氨基苯磺酸溶液，待比色管中溶液靜置10 min左右，管內(nèi)會(huì)產(chǎn)生少量的重氮鹽，為了防止重氮鹽對(duì)亞硝酸鈉含量的干擾，再向比色管中添加鹽酸萘乙二胺溶液定容，分解比色管中的重氮鹽，此時(shí)比色管中需要具體加入的相關(guān)溶劑見(jiàn)表1。

表1比色管中需要具體加入的相關(guān)溶劑量Table 1 The specific solvent amount added into the colorimetric tube mL

(1)應(yīng)用分光光度計(jì)吸取比色管中的樣品溶液與亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液各0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL，并分別將不同濃度的樣品溶液與標(biāo)準(zhǔn)溶液放置于50 mL容量的量筒中；

(2)再分別向每個(gè)量筒中加入2 mL氨基苯磺酸試劑，與樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液完全混合，靜置5～6 min后再向各個(gè)量筒中加入鹽酸萘乙二胺溶液；

(3)將量筒內(nèi)的溶液搖勻，再靜置5 min左右，用比色杯對(duì)不同濃度的樣品溶液與標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行不同波長(zhǎng)的測(cè)定吸取，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線在分光光度計(jì)中體現(xiàn)。

不同濃度下的分光光度計(jì)曲線測(cè)定圖見(jiàn)圖2。

圖2 不同濃度下的分光光度計(jì)曲線測(cè)定圖

1.3 改良法分光光度計(jì)性能測(cè)試

本文應(yīng)用改良法的分光光度計(jì)對(duì)食品中亞硝酸鈉含量進(jìn)行測(cè)定，具有一定的自動(dòng)化性能，相對(duì)于普通的分光光度計(jì)更加智能化，在實(shí)驗(yàn)測(cè)定前需要對(duì)改良法分光光度計(jì)進(jìn)行性能測(cè)定，確定分光光度計(jì)對(duì)亞硝酸鈉的波長(zhǎng)識(shí)別能力、雜光識(shí)別能力、散光吸收能力有著良好的穩(wěn)定性[7-9]。

根據(jù)國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局對(duì)分光光度計(jì)相關(guān)儀器的參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)，儀器設(shè)備對(duì)雜散光的吸收精準(zhǔn)度不得小于2.3；吸光度的范圍在標(biāo)準(zhǔn)值范圍的±5%內(nèi)，且最大的吸光程度不得大于2；分光光度計(jì)的運(yùn)行穩(wěn)定性變化不得超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)值的0.02；分光光度計(jì)的精準(zhǔn)程度見(jiàn)表2。

表2 分光光度計(jì)吸光精準(zhǔn)程度表Table 2 Spectrophotometer absorption precision degree table

首先進(jìn)行雜散光的測(cè)試，由于分光光度計(jì)在340 nm紫外線環(huán)境中的感光能力較弱，相對(duì)于其他測(cè)定設(shè)備信噪比較低，導(dǎo)致雜散光的干擾對(duì)測(cè)定結(jié)果有著較大的影響，測(cè)定時(shí)需要應(yīng)用濃度達(dá)到100 mL/L的亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液作為測(cè)試樣本，用蒸餾水作為該測(cè)試實(shí)驗(yàn)的對(duì)比因變量，獲取蒸餾水的雜散光測(cè)定結(jié)果為4.02，符合標(biāo)準(zhǔn)要求[10]。

再測(cè)試分光光度計(jì)吸光度準(zhǔn)確性，分別應(yīng)用濃度為50，60 mL/L的重鉻酸鉀溶液與亞硝酸鈉溶液進(jìn)行吸光測(cè)定，在分光光度計(jì)中分別進(jìn)行3次重復(fù)性測(cè)試，計(jì)算3次測(cè)試平均值來(lái)衡量改良法分光光度計(jì)的吸光準(zhǔn)確度。吸光度準(zhǔn)確度測(cè)量數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。

表3吸光度準(zhǔn)確度測(cè)量數(shù)據(jù)Table 3 Absorbance accuracy measurement data

最后對(duì)分光光度計(jì)的吸光度范圍進(jìn)行測(cè)試，根據(jù)改良法分光光度計(jì)的標(biāo)準(zhǔn)吸光度閾值可知，分光光度計(jì)能夠確定食品中亞硝酸鈉含量的可測(cè)試光波長(zhǎng)在250～350 nm之間。

為了能夠保障分光光度計(jì)在一定范圍內(nèi)的波長(zhǎng)進(jìn)行穩(wěn)定測(cè)試，本文將按照食品中亞硝酸鈉原液含量的配比進(jìn)行重新配制分光光度計(jì)可識(shí)別色素，色素原液的配比原料見(jiàn)表4。

表4 色素原液的配比原料Table 4 The raw materials' ratios of pigment stock solution

分光光度計(jì)在食品中識(shí)別出的亞硝酸鈉測(cè)定含量的整體結(jié)果受到吸光度的范圍性影響，而本文按照吸光度中的兩種重要組成溶質(zhì)的不同比例來(lái)計(jì)算吸光度的間接表現(xiàn)數(shù)據(jù)。

重鉻酸鉀溶質(zhì)和橘紅G在分光光度計(jì)中表現(xiàn)的吸光度測(cè)試數(shù)據(jù)見(jiàn)表5和表6。

表5 重鉻酸鉀溶質(zhì)在分光光度計(jì)中的吸光度測(cè)試數(shù)據(jù)Table 5 The testing data of absorbance of potassium dichromate solute in spectrophotometer

表6 橘紅G溶質(zhì)在分光光度計(jì)中的吸光度測(cè)試數(shù)據(jù)Table 6 The testing data of absorbance of orange G solute in spectrophotometer

續(xù) 表

由表5和表6可知，兩種溶質(zhì)在分光光度計(jì)中對(duì)亞硝酸鈉吸光準(zhǔn)確度的范圍影響程度小于10%，達(dá)到了實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的基本要求。

2 結(jié)果與分析

應(yīng)用改良法分光光度計(jì)在肉類(lèi)食品中測(cè)定的亞硝酸鈉波長(zhǎng)為534 nm，分別在不同濃度溶液與標(biāo)準(zhǔn)液中進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)度的測(cè)試與吸光度等因素的測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣本中測(cè)定數(shù)據(jù)與樣品中亞硝酸鈉的測(cè)定數(shù)據(jù)共同獲取曲線公式，從而計(jì)算得到亞硝酸鈉在食品中的精準(zhǔn)數(shù)據(jù)。改良法分光光度計(jì)中測(cè)量的亞硝酸鈉制備溶液參數(shù)見(jiàn)表7。

設(shè)定亞硝酸鈉質(zhì)量在分光光度計(jì)中的工作曲線為橫坐標(biāo)值，吸光度在分光光度計(jì)工作曲線中為縱坐標(biāo)值，亞硝酸鈉在分光光度計(jì)中的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線圖見(jiàn)圖3。

改良法下的分光光度計(jì)工作曲線計(jì)算公式為：

式中：X代表食品中亞硝酸鈉的含量，mg/kg；A代表實(shí)驗(yàn)測(cè)量樣品中亞硝酸鈉在分光光度計(jì)中的質(zhì)量，μg；m代表食品中的亞硝酸鈉質(zhì)量，g；V代表樣品溶液的體積，mL；V0代表分光光度計(jì)中的樣品總體積。應(yīng)用公式對(duì)改良法下的分光光度計(jì)中樣品溶液亞硝酸鈉含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表8。

實(shí)驗(yàn)中兩次的含量測(cè)定結(jié)果分別為3.23 g與5.36 g，兩次的亞硝酸鈉含量測(cè)定均具有獨(dú)立性，平均值與相應(yīng)的具體精準(zhǔn)數(shù)據(jù)活動(dòng)范圍在10%內(nèi)，符合標(biāo)準(zhǔn)的分光光度計(jì)計(jì)劃結(jié)果，根據(jù)GB 2760-2011《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中亞硝酸鈉的食品添加劑注意事項(xiàng)中可知，大多數(shù)應(yīng)用亞硝酸鈉添加劑的食品中會(huì)有大量的殘留，當(dāng)肉類(lèi)食品中亞硝酸鈉的殘留量小于30 mg/kg時(shí)則證明實(shí)驗(yàn)中的亞硝酸鈉含量在合格的范圍內(nèi)，因此能夠?qū)κ称分衼喯跛徕c含量的精準(zhǔn)測(cè)定關(guān)乎食品的質(zhì)量是否合格。

本實(shí)驗(yàn)先應(yīng)用文獻(xiàn)[1]中的色譜對(duì)比法進(jìn)行食品亞硝酸鈉含量測(cè)定，應(yīng)用電子秤稱(chēng)取n質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)樣品，樣品中引用的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)量評(píng)定方法。根據(jù)量筒中樣品的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定參數(shù)確定色譜對(duì)比方法中容易引起實(shí)驗(yàn)結(jié)果變化的原因，對(duì)樣品進(jìn)行定容與實(shí)驗(yàn)環(huán)境的改善，在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下溫度的變化范圍在±5 ℃內(nèi)，樣品在標(biāo)準(zhǔn)溶劑中的膨脹系數(shù)確定為2.36×10-3/℃，假設(shè)亞硝酸鈉在量筒中的分布狀態(tài)均勻，進(jìn)行色譜對(duì)比獲取亞硝酸鈉含量數(shù)據(jù)。再用電化學(xué)分析法，將含有亞硝酸鈉的食品用電子秤稱(chēng)取相同質(zhì)量的樣品，應(yīng)用電解析的方式獲取食品中亞硝酸鈉的含量，再用電子秤稱(chēng)取經(jīng)過(guò)電解后的亞硝酸鹽，利用質(zhì)量的差值獲取亞硝酸鈉的含量數(shù)據(jù)。對(duì)3種不同的測(cè)定方法進(jìn)行對(duì)比，測(cè)定食品中亞硝酸鈉的精準(zhǔn)程度結(jié)果，見(jiàn)圖3。

圖3 測(cè)定食品中亞硝酸鈉的精準(zhǔn)程度結(jié)果Fig.3 The determination results of the accuracy of sodium nitrite in food

由圖3可知，本文應(yīng)用的改良法下的分光光度計(jì)對(duì)食品中亞硝酸鈉含量測(cè)定精準(zhǔn)度更高。改良法下分光光度計(jì)中添加氨基苯磺酸溶液與鹽酸萘乙二胺等化學(xué)物質(zhì)提高亞硝酸鈉在分光光度計(jì)中的測(cè)定有效量。

3 結(jié)束語(yǔ)

本文根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.33-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定》中的分光光度計(jì)進(jìn)行改良后的測(cè)定方法進(jìn)行食品中亞硝酸鈉含量的測(cè)定，具有操作簡(jiǎn)單、測(cè)定精準(zhǔn)程度高、干擾因素少、測(cè)定結(jié)果體現(xiàn)快等優(yōu)勢(shì)，通過(guò)可見(jiàn)光的形式即可表現(xiàn)出亞硝酸鈉含量。測(cè)定實(shí)驗(yàn)中首先應(yīng)用6組樣品作為分光光度計(jì)的測(cè)定含量的對(duì)比組，取幾組樣品的測(cè)定平均值為最終的測(cè)量結(jié)果依據(jù)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)的最終數(shù)據(jù)可知，文獻(xiàn)[1]、文獻(xiàn)[2]中應(yīng)用的方法對(duì)亞硝酸鈉含量測(cè)定精準(zhǔn)度均小于本文方法的測(cè)定精準(zhǔn)度。