劉曉艷，覃旋，錢敏，白衛(wèi)東*，黃漢聰，楊紅，黃丹彤

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 輕工食品學(xué)院，廣州 510225；2.廣州市廣式傳統(tǒng)食品加工與安全控制 重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510225；3.廣州市如豐果子調(diào)味食品有限公司，廣州 510300)

作為我國傳統(tǒng)的調(diào)味食品，醬油一般是以大豆或脫脂大豆、小麥或麩皮等為原料，經(jīng)多種微生物共同發(fā)酵而成。醬油的香氣是評價其質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，而乙醇是醬油重要的特征香氣成分[1-4]，乙醇的含量對醬油的營養(yǎng)價值與衛(wèi)生指標(biāo)也有重要影響[5-7]。日本對出口的A級醬油規(guī)定，其乙醇的含量要大于800 mg/dL[8]。目前我國醬油生產(chǎn)中采用的純種發(fā)酵技術(shù)使得所生產(chǎn)的醬油香氣較單薄，所以醬油的生產(chǎn)將傾向于在發(fā)酵中后期添加特定酵母菌來加強(qiáng)酒精發(fā)酵，以產(chǎn)生適量的乙醇改善醬油的風(fēng)味[9-11]。因此，檢測醬油中乙醇含量是醬油生產(chǎn)過程中控制質(zhì)量、指導(dǎo)生產(chǎn)不可缺少的手段。目前，采用氣相色譜對酒類、藥品、香精香料化妝品中微量乙醇進(jìn)行分析檢測的報道較多[12-18]，而醬油中乙醇的氣相色譜分析尚未見文獻(xiàn)報道。

本文采用氣相色譜對醬油中微量乙醇進(jìn)行分析測試，省去了傳統(tǒng)測試方法中蒸餾過程與手工測定比重等繁瑣操作，大大簡化了乙醇測試的操作過程；且減少了萃取、蒸餾等處理過程中乙醇的損失。分析的速度快、干擾小、靈敏度高、數(shù)據(jù)可靠，適用于醬油生產(chǎn)及醬油產(chǎn)品中微量乙醇的檢測，研究結(jié)果為醬油釀造過程中質(zhì)量控制及保證醬油品質(zhì)提供了技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)原料：醬油，購于超市。

乙醇、乙腈(色譜純)：Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7820A氣相色譜儀 安捷倫科技有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 東京理化器械獨(dú)資工廠；Milli-Q超純水器 美國Millipore公司；離心機(jī)、渦旋混合器 美國Scientific Industries公司。

1.3 方法

1.3.1 萃取方法的選擇

取5，2，2 mL醬油至 15 mL 離心管中，分別加入5，8，10 mL乙腈，擰緊瓶蓋，漩渦混勻1 min，以4000 r/min離心3 min，將上層有機(jī)相轉(zhuǎn)入進(jìn)樣瓶中，供 GC測試。

對比醬油樣品與乙腈的在V(醬油)∶V(乙腈)為1∶1(5 mL醬油+5 mL乙腈)、V(醬油)∶V(乙腈)為1∶4 (2 mL醬油+8 mL乙腈)、V(醬油)∶V(乙腈)為1∶5(2 mL醬油+10 mL乙腈)時樣品中乙醇提取的量，得到萃取的最佳條件。

1.3.2 色譜分析條件

色譜柱：HP-INNOWAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；FID檢測器溫度：250 ℃；氫氣流速：35 mL/min；空氣流速：400 mL/min；尾吹(N2)流速：25 mL/min；柱流速：1 mL/min；分流比30∶1；進(jìn)樣口溫度：200 ℃；柱溫平衡時間：1.0 min；程序升溫：40 ℃保持5.5 min，以20 ℃/min的速度升至200 ℃，保持后，運(yùn)行30 min。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取乙醇1.0000 g，用超純水定容到100 mg/L容量瓶中，得到10 mg/mL的儲備液；分別準(zhǔn)確量取10.0 mg/mL儲備液0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL于100 mL容量瓶中，用超純水定容，得到濃度為10，20，40，60，80，100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。按 1.3.2色譜分析條件上機(jī)測定。以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的峰面積值為縱坐標(biāo)，繪制乙醇標(biāo)準(zhǔn)曲線；并進(jìn)行線性回歸，計(jì)算相關(guān)系數(shù)R2。

1.3.4 方法精密度

取3種醬油樣品，每種2 mL 至 15 mL 離心管中，采用 1.3.1 優(yōu)化后的樣品提取方法萃取后，按 1.3.2色譜分析條件上機(jī)分析，每種樣品由同一操作人員連續(xù)重復(fù)分析檢測 6 次。根據(jù)乙醇標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出乙醇含量，并計(jì)算方法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

1.3.5 加標(biāo)回收率

分別取2 mL 醬油于3個15 mL離心管中，加入乙醇對照品(乙醇濃度分別200，300，500 mg/L)，制備成3組不同濃度的樣品。采用 1.3.1 優(yōu)化后的樣品提取方法萃取后，按 1.3.2 色譜條件進(jìn)樣，上機(jī)測定，所得的乙醇含量減去醬油樣品中的乙醇含量，即為加入乙醇的實(shí)測值。將實(shí)測值與理論值比較，得到方法的回收率。

1.3.6 方法的初步應(yīng)用

采用本文建立的方法檢測5種市售醬油中的乙醇含量，重復(fù)檢測5次。

2 結(jié)果與分析

2.1 萃取條件的選擇

使用乙腈為醬油中乙醇的萃取劑時，乙腈的用量對萃取結(jié)果有重要影響。分析比較不同乙腈用量對醬油中乙醇萃取結(jié)果的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 不同乙腈用量對乙醇萃取結(jié)果的影響Fig.1 The effect of acetonitrile volume on ethanol extraction

由圖1可知，當(dāng)V(醬油)∶V(乙腈)為1∶4(8 mL乙腈+2 mL醬油)時，所檢測的乙醇含量最高，說明當(dāng)V(醬油)∶V(乙腈)為1∶4(8 mL乙腈+2 mL醬油)時萃取效果最好。

2.2 線性范圍和檢出限

取1.3.3配制的100 μg/L乙醇標(biāo)品工作液，在1.3.2色譜分析條件下進(jìn)行分析測定，得100 μg/L乙醇標(biāo)品的氣相色譜圖，見圖2。

圖2 100 μg/L乙醇標(biāo)品的氣相色譜圖Fig.2 Gas chromatogram of 100 μg/L ethanol standard solution

由圖2可知，在該色譜條件下，乙醇的保留時間為4.327 min，色譜峰分離良好。

將配制好的6個標(biāo)準(zhǔn)工作溶液在1.3.2色譜條件下測定，得到乙醇含量。以標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制乙醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸(見圖3)，計(jì)算相關(guān)系數(shù)。

圖3 乙醇標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 The standard curve of ethanol

由圖3可知，乙醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=0.2844x+0.1374，相關(guān)系數(shù)R2=0.998，說明當(dāng)乙醇濃度在10～100 mg/L范圍時，方法的線性關(guān)系良好；以3倍信噪比(S/N=3)確定檢測限2.3 mg/L，滿足微量乙醇的定量分析要求。

2.3 精密度試驗(yàn)

采用本方法對3個醬油樣品中乙醇分別進(jìn)行了 6 次平行獨(dú)立測定，以考察檢測方法的精密度，結(jié)果見表1。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=5)Table 1 The precision test results(n=5)

由表1可知，3組測定結(jié)果的RSD分別為2.61%、2.80%、2.55%，說明采用本方法的精密度良好。

2.4 加標(biāo)回收率

對醬油樣品中乙醇進(jìn)行了加標(biāo)回收試驗(yàn)，3種不同濃度加標(biāo)水平為200，300，500 mg/L。按以上試驗(yàn)方法進(jìn)行測定，計(jì)算醬油中乙醇的平均加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見表2。

表2 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The recovery test results

由表2可知，本方法的加標(biāo)回收率為97.86%～101.87%，RSD為0.58%～2.91%，說明本方法的準(zhǔn)確度能夠滿足醬油中微量乙醇的分析要求。

2.5 醬油樣品的測定

按照本文建立的方法測定了市場上5種醬油中乙醇的含量，結(jié)果見表3。

表3 實(shí)樣測試結(jié)果Table 3 The sample testing results

由表3可知，5種醬油中乙醇的含量為479.60～4809.33 mg/L，與相關(guān)報道一致[19-20]；上述5種醬油中乙醇的含量與日本出口的A級醬油中乙醇的含量尚有一定差距，可能與我國醬油生產(chǎn)廠家忽視了對乙醇含量的檢測和醬油發(fā)酵工藝的研究有關(guān)。RSD在0.85%～3.78%，說明本文建立的采用氣相色譜測定醬油中微量乙醇的方法有良好的適用性，能夠滿足醬油中微量乙醇的檢測要求。

3 結(jié)論

本文建立了氣相色譜測定醬油中微量乙醇的方法：采用乙腈為溶劑，醬油∶乙腈為1∶4(V/V)。該方法線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.998，檢出限為2.3 mg/L，樣品的加標(biāo)回收率為97.86%～101.87%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.58%～2.91%。實(shí)際樣品分析結(jié)果表明，該方法具有前處理簡便、分析時間短等特點(diǎn)，而且其精密度高，能滿足醬油生產(chǎn)及醬油產(chǎn)品中微量乙醇的檢測，研究結(jié)果為醬油釀造過程中質(zhì)量控制及保證醬油品質(zhì)提供了技術(shù)支持。