李雨萌，曾里，吳正云

(四川大學(xué) 輕工科學(xué)與工程學(xué)院，成都 610065)

1 概述

四川泡菜是我國傳統(tǒng)特色發(fā)酵食品的典型代表之一。我國泡菜以自然發(fā)酵為主，即利用依附在蔬菜本表面的微生物，加入食鹽水進(jìn)行發(fā)酵制成的產(chǎn)品，泡菜發(fā)酵口感爽脆、風(fēng)味獨(dú)特。已有研究表明[1-3]，老壇水發(fā)酵和接種發(fā)酵泡菜的品質(zhì)皆優(yōu)于自然發(fā)酵，但目前國內(nèi)泡菜行業(yè)仍多采用自然發(fā)酵(二輪鹽漬工藝)[4]。云琳等對不同發(fā)酵方式蘿卜泡菜的品質(zhì)差異進(jìn)行了 研究，研究表明老壇水發(fā)酵和接種發(fā)酵泡菜中的風(fēng)味物質(zhì)皆比自然發(fā)酵中豐富，接種發(fā)酵與老壇水泡菜間揮發(fā)性物質(zhì)存在差異的原因和機(jī)理仍待探究。故本研究采用老壇水和接種菌劑兩種方法發(fā)酵豇豆，監(jiān)測發(fā)酵過程中細(xì)菌群落和揮發(fā)性物質(zhì)的變化，分析發(fā)酵液中細(xì)菌群落組成與揮發(fā)性物質(zhì)的差異性，進(jìn)一步從微生物角度探究兩種發(fā)酵方式揮發(fā)性物質(zhì)差異性的原因，旨在為接種泡菜工業(yè)化發(fā)展提供一定的理論支持和參考。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

2.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品與試劑

老壇水：取自發(fā)酵時間1年左右的老壇水；豇豆：購于郭家橋農(nóng)貿(mào)市場。用郭家橋農(nóng)貿(mào)市場購買的土陶罐泡制。每種方法設(shè)置3個平行樣本。

2.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水真空泵 上海邦西儀器科技有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 北京科偉永興儀器有限公司；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本島津公司；固相微萃取頭、固相微萃取進(jìn)樣手柄 西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；E.Z.N.A.水樣DNA提取試劑盒 美國Omega公司；ABI GeneAmp 9700型PCR儀 美國ABI公司；MISEQ測序儀 美國Illumina公司。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 發(fā)酵工藝

老壇水發(fā)酵：豇豆用無菌水清洗3遍，加入40 g/L老壇泡菜水，裝壇密封發(fā)酵。

接種發(fā)酵泡菜的制備：植物乳桿菌和腸膜明串珠菌等比例接種[5]，接種比例為0.5%，其他工藝同老壇水發(fā)酵。

檢測樣的制備：豇豆和泡菜液按質(zhì)量1∶1混合均漿。

2.2.2 泡菜樣品揮發(fā)性成分的固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(SPME-GC-MS)分析

固相微萃取(SPME)條件：取5 g泡菜樣品加入頂空瓶中，在50 ℃水浴條件下平衡15 min。然后插入萃取針，在泡菜樣品上空萃取20 min,然后拔出萃取針并插入GC-MS進(jìn)樣口中，熱解吸5 min進(jìn)行分析。

氣相色譜(GC)條件：色譜柱：DB-5MS(30 m×0.25 mm，0.25 μm)。GC程序(總程序時間55 min)：初溫40 ℃，保持3 min；以5 ℃/min升溫至100 ℃；然后以3 ℃/min升溫至175 ℃；最后以10 ℃/min升溫至215 ℃，保持10 min，不分流，進(jìn)樣口溫度250 ℃。

質(zhì)譜(MS)條件：電子轟擊離子源(EI)，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，接口溫度250 ℃，質(zhì)譜掃描范圍(m/z)：35.00～400.00。

2.2.3 微生物群落檢測

利用E.Z.N.A.?水樣DNA提取試劑盒進(jìn)行細(xì)菌群落總DNA抽提。對16S rRNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min，27個循環(huán)(95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s)，然后以72 ℃穩(wěn)定延伸10 min，最后在4 ℃進(jìn)行保存。PCR反應(yīng)體系：5×TransStart FastPfu緩沖液4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，上游引物(5 μmol/L)0.8 μL，下游引物(5 μmol/L) 0.8 μL,TransStart FastPfu DNA聚合酶0.4 μL，模板DNA 10 ng。擴(kuò)增后進(jìn)行PCR產(chǎn)物的回收、定量。根據(jù) Illumina MiSeq平臺標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)建PE 300的文庫。

3 結(jié)果與討論

3.1 老壇水、接種泡豇豆發(fā)酵過程中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

研究發(fā)現(xiàn)[6-7]，泡菜發(fā)酵階段與風(fēng)味物質(zhì)相關(guān)的重要微生物主要是細(xì)菌群落，故本文主要對細(xì)菌群落進(jìn)行研究。

兩種豇豆泡菜在0～15 d發(fā)酵周期的細(xì)菌群落的變化情況見圖1和圖2。

圖1 老壇水和接種發(fā)酵豇豆泡菜細(xì)菌門水平群落結(jié)構(gòu)組成Fig.1 The community structure composition in the phylum level of bacteria in laotan water fermented and inoculation fermented cowpea pickles

圖2 老壇水和接種發(fā)酵豇豆泡菜細(xì)菌屬水平群落結(jié)構(gòu)組成Fig.2 The community structure composition in the genus level of bacteria in laotan water fermented and inoculation fermented cowpea pickles

在門水平上，老壇水泡豇豆中的主要細(xì)菌門類是厚壁菌門(Firmicutes)、Epsilonbacteraeota和變形菌門(Proteobacteria),另有少量放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、梭桿菌門(Fusobacteria)、哈拉厭氧菌門(Halanaerobiaeota)和藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)。接種泡豇豆中的主要細(xì)菌門類是厚壁菌門(Firmicutes)，其他門類相對豐度甚微。屬水平上，接種發(fā)酵豇豆中細(xì)菌群落豐度遠(yuǎn)不如老壇水發(fā)酵豇豆。老壇水泡豇豆中優(yōu)勢菌屬是乳桿菌屬(Lactobacillus)、弓形桿菌屬(Arcobacter)、片球菌屬(Pediococcus)及嗜鹽單胞菌屬(Halomonas)。接種泡豇豆中優(yōu)勢菌屬是乳桿菌屬(Lactobacillus)和鹽厭氧菌屬(Halanaerobium)，少量嗜鹽單胞菌屬(Halomonas)。接種泡豇豆發(fā)酵過程中，由于接種的乳酸菌和腸膜明串珠菌皆屬于乳桿菌屬，故發(fā)酵初始乳酸菌屬相對豐度高，加上發(fā)酵過程產(chǎn)酸，抑制了其他菌的生長，保持了乳酸菌的優(yōu)勢地位，發(fā)酵后期相對豐度接近98%。老壇水泡菜發(fā)酵過程中乳酸菌屬相對豐度先上升后下降，原因是隨著發(fā)酵的進(jìn)行乳酸菌產(chǎn)酸雜菌,生長受到抑制，乳酸菌屬的相對豐度上升。而乳酸菌非絕對優(yōu)勢菌群，因此當(dāng)發(fā)酵后期酸度降到一定值時，乳酸菌自身生長受到抑制，其他菌種開始慢慢增長。

3.2 老壇水、接種發(fā)酵豇豆泡菜發(fā)酵過程中揮發(fā)性成分分析

續(xù) 表

圖3 老壇水豇豆泡菜發(fā)酵過程中揮發(fā)性成分相對含量的變化Fig.3 The change in relative content of volatile components in the fermentation process of laotan water fermented cowpea pickles

圖4 接種豇豆泡菜發(fā)酵過程中揮發(fā)性成分相對含量的變化Fig.4 The change in relative content of volatile components in the fermentation process of inoculation fermented cowpea pickles

泡菜的發(fā)酵過程主要為乳酸菌的乳酸發(fā)酵，發(fā)酵前期主要進(jìn)行異型乳酸發(fā)酵，產(chǎn)生醇類、醛類、有機(jī)酸；發(fā)酵后期主要進(jìn)行同型乳酸發(fā)酵，產(chǎn)生乳酸。發(fā)酵過程除產(chǎn)生大量乳酸外，還會形成乙酸、丙酸等有機(jī)酸和異戊醇、丁醇等醇類物質(zhì)。隨著發(fā)酵進(jìn)行這些有機(jī)酸又會與醇類反應(yīng)生成乙酸乙酯、乳酸異戊酯等酯類揮發(fā)性成分[8]。由表1可知，在老壇水泡豇豆中檢測出的揮發(fā)性風(fēng)味成分約有41種，其中有15種為老壇水泡豇豆獨(dú)有。老壇水泡豇豆含量較高的揮發(fā)性物質(zhì)是酯類、醇類和酸類，以酯類為主。在接種泡豇豆中檢測出的揮發(fā)性風(fēng)味成分約有36種，其中11種為接種泡豇豆獨(dú)有。接種泡豇豆含量較高的揮發(fā)性物質(zhì)是醇類、酯類、酸類及含硫化合物。老壇水泡豇豆的醇類和酯類的種類和相對含量皆高于接種泡豇豆。由圖3和圖4可知，兩種發(fā)酵方式的主要風(fēng)味成分酯類、酸類物質(zhì)都呈先上升后下降的趨勢，醇類物質(zhì)的相對含量變化不大。接種泡豇豆發(fā)酵過程中含硫化合物從發(fā)酵第9天開始檢出，且相對含量迅速增加。

與現(xiàn)有蘿卜等研究結(jié)果不同[9-10]，由于豇豆本身酯類化合物含量高[11]，故酯類物質(zhì)雖然本身閾值較大，仍對泡豇豆風(fēng)味有積極影響。老壇水泡豇豆酯類相對含量明顯高于接種發(fā)酵，說明老壇發(fā)酵更能保留豇豆本身風(fēng)味。醇類物質(zhì)在整個發(fā)酵周期相對含量較穩(wěn)定。醇類物質(zhì)一部分是原料本身具有的，另一部分則是微生物發(fā)酵產(chǎn)生的；此外，醇類物質(zhì)還能與有機(jī)酸反應(yīng)生成酯類物質(zhì)，為泡菜的香氣做出一定的貢獻(xiàn)。在醇類物質(zhì)中，大部分對豇豆泡菜的風(fēng)味有積極影響，如α-松油醇具有紫丁香氣味，芳樟醇具有花香味，1-辛烯-3-醇有菜豆香[12]。異戊醇還具有烘托酯香的作用，能夠使香味更豐腴。但也存在給泡菜帶來不良風(fēng)味的醇類物質(zhì)，如3-甲基-1-丁醇，有辛辣而令人厭惡的不愉快氣味。異戊醇、芳樟醇及α-松油醇等對風(fēng)味有積極影響的醇類物質(zhì)含量在老壇水泡豇豆中更高，而產(chǎn)生不愉快氣味的3-甲基-1-丁醇則在接種泡豇豆中含量更高，且老壇水泡豇豆總醇相對含量明顯高于接種發(fā)酵泡豇豆。酸類物質(zhì)含量較高時，對豇豆泡菜良好風(fēng)味的形成有一定的積極作用。如含量最多的乙酸，一方面可以降低泡菜的pH值，促進(jìn)泡菜的成熟，另一方面可以為泡菜增加柔和的酸味。酸類在泡菜的發(fā)酵過程中呈增長的趨勢，原因是在發(fā)酵過程中對異型乳酸發(fā)酵的菌株進(jìn)行代謝的產(chǎn)物有一部分是乙酸。老壇水泡豇豆酸類物質(zhì)和醇類含量大多高于接種泡豇豆，二者間發(fā)生反應(yīng)生成的酯類物質(zhì)也就更加豐富，對后期泡菜良好香味有積極作用。

其他物質(zhì)方面，醛類物質(zhì)的閾值低，雖含量不多，但對豇豆泡菜的風(fēng)味有一定的影響。壬醛能賦予泡菜清香味，而糠醛、苯甲醛、3-甲氧基-丙醛則會給豇豆泡菜帶來刺激性氣味。老壇水泡豇豆中壬醛含量穩(wěn)定，且刺激性醛類隨著發(fā)酵的進(jìn)行而降低或消失，接種泡豇豆中刺激性醛類則隨著發(fā)酵時長的增加而增加。泡菜中的胺類物質(zhì)是不良?xì)馕兜闹饕獊碓?。接種泡菜中出現(xiàn)的胺類物質(zhì)會影響泡菜的氣味。而含硫化合物的香味閾值極低，低濃度時呈現(xiàn)令人愉悅的香味的含硫化合物在高濃度時都具有強(qiáng)烈的令人厭惡的氣味。豇豆不屬于十字花科，本身不含硫[13]，而是中后期由于微生物發(fā)酵的作用產(chǎn)生的。兩種泡豇豆的含硫化合物均從第9天開始檢出，后期呈現(xiàn)上升趨勢。對比發(fā)現(xiàn)，老壇水泡豇豆含硫化合物的相對含量較低，對泡菜風(fēng)味有積極作用。接種泡菜在發(fā)酵后期含硫化合物的相對含量增幅巨大，反而會帶來不良?xì)馕?，故在接種發(fā)酵過程中應(yīng)該嚴(yán)格控制發(fā)酵時長。

4 關(guān)聯(lián)性分析

為了更好地揭示泡菜中揮發(fā)性組分與細(xì)菌群落之間的相互關(guān)系，采用冗余分析(RDA)方法，將泡菜樣品中的細(xì)菌群落特征作為物種，泡菜中特征揮發(fā)性組分作為環(huán)境因素，對兩個樣本進(jìn)行RDA分析[14-15]，見圖5。

圖5 老壇水和接種發(fā)酵豇豆泡菜細(xì)菌群落 與揮發(fā)性成分RDA分析Fig.5 The RDA analysis of bacterial community and volatile components in laotan water fermented and inoculation fermented cowpea pickles

由圖5可知，與老壇水泡豇豆細(xì)菌群落相關(guān)性最大的揮發(fā)性成分是酯類和醇類，其次為酸類、酚類；與接種泡菜細(xì)菌群落相關(guān)性最大的揮發(fā)性成分是含硫化合物，其次是胺類。且兩種方式發(fā)酵的豇豆都呈現(xiàn)發(fā)酵前期微生物群落與醇類、酯類、酸類相關(guān)性較大，發(fā)酵后期細(xì)菌群落與醛類、含硫化合物、胺類相關(guān)性更大的特征，這與泡菜發(fā)酵前期主要進(jìn)行異型乳酸發(fā)酵而后期主要進(jìn)行同型乳酸發(fā)酵的特點(diǎn)相符。對在兩種泡豇豆中相對豐度排名前三的物種與揮發(fā)性物質(zhì)相關(guān)性進(jìn)行分析可知，乳桿菌屬(Lactobacillus)對揮發(fā)性風(fēng)味成分的形成幾乎沒有影響，而弓形桿菌屬(Arcobacter)、片球菌屬(Pediococcus)對酯類、醇類、酸類、酚類揮發(fā)性物質(zhì)的形成有影響，老壇水泡菜由于細(xì)菌群落豐富，對多種揮發(fā)性成分形成有利。而接種泡菜中乳桿菌屬在初始發(fā)酵時相對豐度達(dá)到93%左右，對接種泡菜揮發(fā)性成分的形成不利。

5 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過對接種泡豇豆和老壇水泡豇豆發(fā)酵過程中的細(xì)菌群落和揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行監(jiān)測分析，探究發(fā)酵液中菌群組成和揮發(fā)性物質(zhì)的差異性，并從微生物角度探究了揮發(fā)性物質(zhì)存在差異性的原因。

采用PCR技術(shù)對從發(fā)酵液中提取的細(xì)菌群落進(jìn)行擴(kuò)增、分析，檢測出老壇水泡豇豆中細(xì)菌群落的豐富度明顯高于接種泡豇豆。老壇水泡豇豆在發(fā)酵過程中，主要細(xì)菌門類是厚壁菌門(Firmicutes)、Epsilonbacteraeota和變形菌門(Proteobacteria)，優(yōu)勢菌屬是乳桿菌屬(Lactobacillus)、弓形桿菌屬(Arcobacter)、片球菌屬(Pediococcus)及嗜鹽單胞菌屬(Halomonas)。接種泡豇豆在發(fā)酵過程中，菌種的相對單一，主要細(xì)菌門類是厚壁菌門(Firmicutes)，優(yōu)勢菌屬是乳桿菌屬(Lactobacillus)和鹽厭氧菌屬(Halanaerobium)，少量嗜鹽單胞菌屬(Halomonas)。接種泡菜發(fā)酵過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，也更容易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)中品質(zhì)的把控；老壇水泡菜發(fā)酵過程中細(xì)菌群落的組成變化較大，較難管控。

采用SPME-GC-MS聯(lián)用法對泡菜發(fā)酵過程中的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分析，檢測出老壇水泡豇豆中揮發(fā)性成分約有41種，接種泡豇豆中檢測出的揮發(fā)性風(fēng)味成分有36種，其中15種為老壇水泡豇豆獨(dú)有，11種為接種泡豇豆獨(dú)有。對泡菜風(fēng)味有積極貢獻(xiàn)的醛類、酚類、酯類物質(zhì)在老壇水泡豇豆中較多，而產(chǎn)生不愉快氣味的胺類物質(zhì)和豐度高時產(chǎn)生不良風(fēng)味的含硫化合物在接種泡豇豆中含量較高。接種發(fā)酵后期產(chǎn)生大量含硫化合物嚴(yán)重影響豇豆泡菜風(fēng)味，證明接種泡菜發(fā)酵時間對風(fēng)味影響相對較大，指導(dǎo)工業(yè)使用接種發(fā)酵時應(yīng)該嚴(yán)格把控發(fā)酵時長，避免含硫化合物和胺類的大量產(chǎn)生。

通過對細(xì)菌群落和揮發(fā)性成分的RDA分析可知，酯類、醇類、酸類、酚類揮發(fā)性物質(zhì)與老壇水泡豇豆中細(xì)菌相關(guān)性較為顯著，醛類、含硫化合物、胺類揮發(fā)性物質(zhì)與接種泡菜中細(xì)菌相關(guān)性較為顯著。老壇水泡菜細(xì)菌群落豐富，弓形桿菌屬(Arcobacter)、片球菌屬(Pediococcus)對酯類、醇類、酸類、酚類揮發(fā)性物質(zhì)的形成有影響，對應(yīng)的揮發(fā)性成分的種類和含量更豐富。而接種泡菜以乳桿菌屬(Lactobacillus)為絕對優(yōu)勢菌屬，該菌屬對揮發(fā)性物質(zhì)的生成幾乎沒有貢獻(xiàn)。指導(dǎo)工業(yè)上采用接種發(fā)酵方法時，可以適當(dāng)豐富菌種、調(diào)整菌群結(jié)構(gòu)，例如無毒害作用且對風(fēng)味有良好影響的片球菌屬，或是在后續(xù)生產(chǎn)中添加增香物質(zhì)。