張雁凌，張雁南，劉剛

(吉林工程技術(shù)師范學(xué)院 食品工程學(xué)院，長(zhǎng)春 130052)

醬油是重要的調(diào)味品，由大豆、面粉、麩皮等原料經(jīng)高溫蒸煮變性和微生物發(fā)酵作用分解為小分子物質(zhì)，并通過各種化學(xué)反應(yīng)形成，醬油是酵母菌和細(xì)菌等微生物綜合作用的產(chǎn)物，在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酶和代謝產(chǎn)物形成了醬油獨(dú)特的色、香、味成分[1]。在醬油發(fā)酵過程中，添加乳酸菌和酵母菌可以產(chǎn)生小分子醇、酸、酯、醛和酚等風(fēng)味物質(zhì)，形成醬油的風(fēng)味[2]。嗜鹽四聯(lián)球菌是醬油發(fā)酵過程中的主要乳酸菌，其產(chǎn)生的有機(jī)酸可與酵母產(chǎn)生的醇類進(jìn)行酸-醇酯化反應(yīng)，形成濃郁的酯香，有效改善醬油的品質(zhì)[3]。魯氏酵母廣泛應(yīng)用于醬油發(fā)酵中，其發(fā)酵產(chǎn)生的醇類物質(zhì)能與有機(jī)酸反應(yīng)形成酯類物質(zhì)，具有較高的風(fēng)味貢獻(xiàn)能力[4-6]。

研究表明，食品中的高鹽已經(jīng)成為誘發(fā)高血壓的主要原因之一，為此，有必要開發(fā)低鹽醬油以迎合人們的健康需求。低鹽醬油由于發(fā)酵過程中溫度較高，不利于微生物的生長(zhǎng)繁殖，因而產(chǎn)生的醬油風(fēng)味不足[7-8]。本文在低鹽醬油發(fā)酵工藝的基礎(chǔ)上，添加嗜鹽四聯(lián)球菌TS71和魯氏接合酵母A22進(jìn)行發(fā)酵，分析比較低鹽醬油添加嗜鹽四聯(lián)球菌TS71和魯氏接合酵母A22前后理化指標(biāo)、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)和生物胺的變化，為乳酸菌和酵母菌在改善低鹽醬油的品質(zhì)方面提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

米曲霉、嗜鹽四聯(lián)球菌TS71、魯氏接合酵母A22、甲醛、乙醇、重鉻酸鉀、葡萄糖、氫氧化鈉、鹽酸；Agilent 1200高效液相色譜儀、GC6890N-MSD5975氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、PHS-25型pH計(jì)、HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋、HP-INNOWAX毛細(xì)管柱。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸菌和酵母菌的添加及低鹽醬油的發(fā)酵

將熟大豆、小麥面粉和大米淀粉按7∶1∶1的比例混合，接種0.2%的米曲霉，在30 ℃環(huán)境下培養(yǎng)2 d，隨后加入12%的鹽水混合制成醬醪。在醬醪中加入嗜鹽四聯(lián)球菌TS71和魯氏接合酵母A22，在室溫下發(fā)酵3個(gè)月，發(fā)酵前和發(fā)酵過程中每月取出500 mL醬醪，無菌分離后用以進(jìn)行分析測(cè)試。發(fā)酵完成后，過濾、離心取上清液，在80 ℃水浴中加熱20 min，分析醬油的物理化學(xué)性質(zhì)，樣品記錄為L(zhǎng)S-TA。采用同樣的發(fā)酵和取樣方法，以不添加嗜鹽四聯(lián)球菌TS71和魯氏接合酵母A22制備的低鹽醬油作為對(duì)照,樣品記錄為L(zhǎng)S。

1.2.2 常規(guī)指標(biāo)和生物胺的測(cè)定

低鹽醬油中氨基酸態(tài)氮和總酸采用國(guó)標(biāo)GB/T 18186-2000規(guī)定的方法測(cè)定，還原糖采用國(guó)標(biāo)GB/T 5009.7-2008規(guī)定的方法測(cè)定，乙醇含量采用重鉻酸鉀比色法測(cè)定，總酯含量采用連續(xù)電位滴定法測(cè)定。生物胺濃度的測(cè)定采用高效液相色譜法。

1.2.3 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定

采用GC-MS對(duì)低鹽醬油中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定。氣相色譜條件：以He為載氣，流速1 mL/min，30 mm×0.25 mm毛細(xì)管柱，起始溫度40 ℃，保溫5 min，然后以5 ℃/min的升溫速率加熱至200 ℃后保溫15 min，再以10 ℃/min的升溫速率加熱至220 ℃后保溫5 min；質(zhì)譜條件：電子能量70 eV，電壓350 V，電流200 μA，溫度200 ℃，掃描范圍30～350 amu。

2 結(jié)果與討論

2.1 低鹽醬油發(fā)酵過程中pH變化趨勢(shì)分析

LS和LS-TA在發(fā)酵期間pH的變化趨勢(shì)見圖1。

圖1 低鹽醬油發(fā)酵過程中pH變化趨勢(shì)Fig.1 Changes of pH during fermentation of low-salt soy sauce

由圖1可知，添加嗜鹽四聯(lián)球菌TS71和魯氏酵母A22對(duì)低鹽醬油發(fā)酵過程中的pH沒有明顯影響。醬醪發(fā)酵最初的pH值在6.7左右，發(fā)酵1個(gè)月后，由于碳水化合物發(fā)酵、氨基酸積累以及微生物細(xì)胞的自我分解，pH降低，繼續(xù)發(fā)酵，pH略有上升，醬油發(fā)酵結(jié)束后的pH保持在4.7左右。

2.2 低鹽醬油理化指標(biāo)分析

添加嗜鹽四聯(lián)球菌TS71和魯氏酵母A22的低鹽醬油發(fā)酵結(jié)束后，取樣測(cè)定其氨基酸態(tài)氮、總酸、總酯、還原糖含量和酒精度，與未添加的低鹽醬油進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果見表1。

表1 LS和LS-TA低鹽醬油理化指標(biāo)對(duì)比Table 1 Comparison of physiochemical indexes of LS and LS-TA low-salt soy sauce

由表1可知，低鹽醬油添加嗜鹽四聯(lián)球菌TS71和魯氏酵母A22后，總酸、總酯含量和酒精度明顯提高，分別由14.82 g/L，68.42 g/L，0.08%vol提高為18.91 g/L，81.66 g/L，1.89%vol，氨基酸態(tài)氮和還原糖含量無明顯變化。添加嗜鹽四聯(lián)球菌TS71和魯氏酵母A22后產(chǎn)生的醇類、酯類和有機(jī)酸類等物質(zhì)增加了醬油的風(fēng)味，相比未添加乳酸菌和酵母菌的低鹽醬油，香味更加濃郁，不良?xì)馕队兴档汀?/p>

2.3 低鹽醬油中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

表2 LS和LS-TA低鹽醬油揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)比Table 2 Comparison of volatile flavor components of LS and LS-TA low-salt soy sauce

續(xù) 表

由表2可知，添加嗜鹽四聯(lián)球菌TS71和魯氏酵母A22后，低鹽醬油的酸類、醇類、酯類、醛類、酚類等主要揮發(fā)性成分的種類和含量相比未作添加的低鹽醬油明顯不同，醇類和酯類物質(zhì)在揮發(fā)性成分中的比例提高，酸類和醛類物質(zhì)的比例降低。

2.3.1 酸類揮發(fā)性物質(zhì)

未作添加的低鹽醬油存在醋酸、丁酸、戊酸、4-甲基戊酸和苯甲酸5種酸類揮發(fā)性物質(zhì)，添加嗜鹽四聯(lián)球菌TS71和魯氏酵母A22后，醬油中的酸類揮發(fā)性物質(zhì)種類和含量均發(fā)生了變化，檢測(cè)到7種酸類揮發(fā)性物質(zhì)，新增了辛酸和癸酸，但酸類物質(zhì)在揮發(fā)性成分中的占比相比未作添加時(shí)明顯降低，由13.81%下降為5.05%，其中醋酸含量變化最為明顯，由9.88%下降為3.27%，酸類物質(zhì)含量降低表明在發(fā)酵過程中，酸類物質(zhì)與酵母代謝產(chǎn)物發(fā)生了反應(yīng)，揮發(fā)性酸類物質(zhì)總量降低，使低鹽醬油的風(fēng)味更為柔和[9-10]。

2.3.2 醇類揮發(fā)性物質(zhì)

未作添加的低鹽醬油中檢測(cè)出7種醇類揮發(fā)性物質(zhì)，分別為異戊醇、苯乙醇、糠醇、異辛醇、4-甲基-1-戊醇、1-辛烯-3-醇、3-甲硫基-1-丙醇，添加嗜鹽四聯(lián)球菌TS71和魯氏酵母A22后，總共的醇類揮發(fā)性物質(zhì)仍為7種，新檢測(cè)出苯甲醇，未檢測(cè)出原有的異辛醇。添加乳酸菌和酵母菌后，低鹽醬油中醇類揮發(fā)性物質(zhì)占比由44.16%增加到59.22%，醇類物質(zhì)總含量明顯提高，其中苯乙醇含量由之前的2.14%增加為9.78%，3-甲硫基-1-丙醇由0.48%增加為0.69%。苯乙醇和3-甲硫基-1-丙醇是對(duì)低鹽醬油香味貢獻(xiàn)最大的兩種特征香氣，苯乙醇是由乙醇發(fā)酵時(shí)苯丙氨酸降解產(chǎn)生的，具有丁香、茴香、紫羅蘭等獨(dú)特香味，3-甲硫基-1-丙醇具有肉湯香味，在較低濃度時(shí)即有濃烈的香味。

2.3.3 醛類揮發(fā)性物質(zhì)

醛類揮發(fā)性物質(zhì)通常不是醬油的特征風(fēng)味成分，但是醛類物質(zhì)可以與醬油中的硫化物和醇類物質(zhì)反應(yīng)，提高醬油的風(fēng)味。未作添加的低鹽醬油中檢測(cè)出6種醛類揮發(fā)性物質(zhì)，分別為糠醛、苯甲醛、壬醛、苯乙醛、茴香醛和α-亞乙基-苯乙醛，添加嗜鹽四聯(lián)球菌TS71和魯氏酵母A22后，低鹽醬油中新增了肉桂醛。添加乳酸菌和酵母菌后，醛類物質(zhì)在總的揮發(fā)性物質(zhì)中占比由10.71%降低為6.42%。

2.3.4 酯類揮發(fā)性物質(zhì)

未作添加的低鹽醬油中檢測(cè)出4種酯類揮發(fā)性物質(zhì)，分別為乳酸乙酯、醋酸苯乙酯、甲烷硫代磺酸-S-甲酯和鄰苯二甲酸二異丁酯，添加乳酸菌和酵母菌后，除以上4種酯類揮發(fā)性物質(zhì)外，還新增了苯乙酸乙酯和乙酸異戊酯兩種酯類物質(zhì)。添加乳酸菌和酵母菌后，酯類揮發(fā)性物質(zhì)占比由1.31%增加至12.65%，除新增酯類物質(zhì)外，原有的酯類物質(zhì)百分含量也顯著增加。未作添加時(shí)，低鹽醬油中未檢測(cè)到乙酸異戊酯，添加乳酸菌和酵母菌后，乙酸異戊酯含量增加為6.27%，醋酸苯乙酯含量從0.48%增加為5.86%。乙酸異戊酸和醋酸苯乙酯均具有新鮮果香味，提升這兩種物質(zhì)的含量有利于改善醬油的風(fēng)味。酯類揮發(fā)性物質(zhì)含量的提高可以歸因于有機(jī)酸類與醇類的酯化作用，這種酯化作用主要由酵母發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酯化酶引起。

2.3.5 其他揮發(fā)性物質(zhì)

添加嗜鹽四聯(lián)球菌TS71和魯氏酵母A22后，低鹽醬油中其他揮發(fā)性物質(zhì)的含量也發(fā)生變化，如愈創(chuàng)木酚等酚類化合物、呋喃等含氧雜環(huán)化合物、吡嗪等含氮化合物。相比未作添加的低鹽醬油，添加嗜鹽四聯(lián)球菌TS71和魯氏酵母A22后，低鹽醬油中的這些化合物的含量有所降低，但是由于這些揮發(fā)性物質(zhì)的風(fēng)味閾值非常低，含量的降低并沒有明顯影響醬油的香味。

2.4 低鹽醬油中的生物胺分析

生物胺廣泛存在于發(fā)酵食品中，正常濃度的生物胺有利于維持細(xì)胞正常的生理功能，但當(dāng)人體攝入生物胺濃度過高時(shí)，可能導(dǎo)致惡心、呼吸紊亂等過敏反應(yīng)，因此，控制低鹽醬油的生物胺含量尤為重要。通常要求醬油中生物胺的總含量不超過50 mg/kg，組胺含量不超過25 mg/kg。添加嗜鹽四聯(lián)球菌TS71和魯氏酵母A22的低鹽醬油與未作添加的低鹽醬油生物胺含量對(duì)比見表3，包括尸胺、腐胺、組胺和酪胺。添加嗜鹽四聯(lián)球菌TS71和魯氏酵母A22后，低鹽醬油中的尸胺、組胺含量由14.82 mg/kg和12.43 mg/kg分別增加到18.91 mg/kg和13.67 mg/kg，腐胺含量由11.29 mg/kg降低為4.12 mg/kg，酪胺含量由1.76 mg/kg降低為0.18 mg/kg，生物胺的總含量由40.3 mg/kg降低為36.88 mg/kg。添加嗜鹽四聯(lián)球菌TS71和魯氏酵母A22的低鹽醬油的組胺含量和生物胺的總含量均滿足要求。

表3 LS和LS-TA低鹽醬油生物胺濃度對(duì)比Table 3 Comparison of bioamines concentration of LS and LS-TA low-salt soy sauce mg/kg

3 結(jié)論

相比未作添加的低鹽醬油，添加嗜鹽四聯(lián)球菌TS71和魯氏酵母A22后發(fā)酵過程中pH變化趨勢(shì)不變，總酸、總酯含量和酒精度分別由14.82 g/L，68.42 g/L，0.08%vol提高為18.91 g/L，81.66 g/L，1.89%vol，氨基酸態(tài)氮和還原糖基本保持不變。揮發(fā)性風(fēng)味成分分析表明，醇類和酯類揮發(fā)性物質(zhì)占比升高，由原來的44.16%和1.31%分別提高至59.22%和12.65%，醛類和酸類揮發(fā)性物質(zhì)占比降低，由原來的10.71%和13.81%分別降低至6.42%和5.05%。添加嗜鹽四聯(lián)球菌TS71和魯氏酵母A22后，低鹽醬油的生物胺由40.3 mg/kg降低為36.88 mg/kg。