馬波，孫林歆，喬友志

(江蘇師范大學(xué) 連云港校區(qū)，江蘇 連云港 222006)

銀杏葉為銀杏科銀杏屬植物銀杏(GinkgobilobaL.)的干燥葉，富含黃酮類物質(zhì)，這些生物活性物質(zhì)具有抗病毒、抗氧化、抗高血壓、降血糖和降血脂等功效[1-2]，作為食品添加劑，如色素、甜味劑、抗氧化劑等，廣泛應(yīng)用于調(diào)味食品、調(diào)色食品和保健食品中[3-7]。目前，從銀杏葉中提取黃酮的方法包括醇提法、超聲法、微波法、酶法和復(fù)合法等[8-15]。

銀杏黃酮類化合物幾乎被以果膠、纖維素為主要物質(zhì)構(gòu)成的細(xì)胞壁所包圍，傳質(zhì)阻力巨大，不利于溶劑進(jìn)入細(xì)胞壁內(nèi)，影響銀杏黃酮的提取效果。液態(tài)發(fā)酵多粘類芽孢桿菌過程中能產(chǎn)生果膠酶，可充分降解提取物細(xì)胞間果膠質(zhì)，降低細(xì)胞間的粘連性，使細(xì)胞壁疏松、破裂，減小傳質(zhì)阻力，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)容物的充分浸出[16-17]，是目前酶法中常用的酶。鑒于此，本文通過多粘類芽孢桿菌發(fā)酵法提取銀杏黃酮，以銀杏黃酮得率為指標(biāo)，在探討了單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用正交試驗優(yōu)化提取條件，為銀杏黃酮的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

銀杏葉：產(chǎn)于江蘇師范大學(xué)連云港校區(qū)，烘干粉碎，過40目篩制成銀杏葉粉；菌種：多粘類芽孢桿菌2018(Paenibacilluspolymyxa)；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、牛肉膏、蛋白胨、蔗糖、玉米漿、葡萄糖、NaCl、KH2PO4、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O：所用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

101-0干燥箱 上海昕儀儀器儀表有限公司；20B高效粉碎機(jī) 常州樂星干燥設(shè)備有限公司；BIOBASE高壓蒸汽滅菌鍋 山東博科科學(xué)儀器有限公司；UV2550分光光度計 日本島津公司；KL-100B恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海凱朗儀器設(shè)備廠；RE-52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 銀杏黃酮含量測定

銀杏黃酮含量測定：以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)，配制不同濃度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液，以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，溶液吸光度為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線，得到質(zhì)量濃度C(mg/mL)與吸光度A關(guān)系的線性回歸方程為C=1.51A+0.0002，R=0.9999。

1.3.2 銀杏黃酮提取得率計算

銀杏黃酮提取得率(%)=(銀杏黃酮含量×提取液體積/所用銀杏葉質(zhì)量)×100%。

1.3.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(m/V)：蛋白胨0.5%，牛肉膏0.3%，NaCl 0.5%，瓊脂2.0%，pH 7.0。

種子培養(yǎng)基(m/V)：蛋白胨1.0%，玉米漿3.0%，蔗糖2.0%，硫酸鎂0.1%，K2HPO4·3H2O 1.8%，KH2PO40.6%，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基(m/V)：蛋白胨0.5%，酵母膏0.5%，葡萄糖1%，K2HPO4·3H2O 0.9%，KH2PO40.3%，pH 7.0。

1.3.4 提取工藝

參考銀杏葉中果膠類物質(zhì)和黃酮類物質(zhì)的性質(zhì)，采取了兩種提取技術(shù)。

1.3.4.1 直接浸提技術(shù)

銀杏葉粉末→浸泡→減壓過濾→濃縮→定容。

取銀杏葉粉末10 g加入200 mL蒸餾水中，在溫度80 ℃浸泡處理24 h，使黃酮類物質(zhì)能夠充分釋放，然后進(jìn)行過濾，取濾液濃縮定容后測銀杏黃酮含量。

1.3.4.2 芽孢桿菌發(fā)酵法提取技術(shù)

銀杏葉粉末→發(fā)酵培養(yǎng)基→滅菌→接種→發(fā)酵→減壓過濾→濃縮定容。

取活化后的多粘類芽孢桿菌兩環(huán)，接入種子培養(yǎng)基中，在搖床溫度35 ℃，轉(zhuǎn)速150 r/min條件下發(fā)酵24 h，培養(yǎng)種子液。將8 g銀杏葉粉末添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中(200 mL)，滅菌后再接入10%的種子培養(yǎng)液，設(shè)置搖床溫度35 ℃，轉(zhuǎn)速180 r/min條件下發(fā)酵24 h。發(fā)酵完成后將發(fā)酵液減壓過濾，取濾液濃縮定容后測銀杏黃酮含量。

1.3.5 優(yōu)化芽孢桿菌發(fā)酵法提取技術(shù)

分別考察種子液菌齡、固液比(銀杏葉粉末質(zhì)量/發(fā)酵培養(yǎng)基體積)、接種量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間的變化對銀杏黃酮提取得率的影響。在此研究的基礎(chǔ)上，通過L9(34)正交表(見表1)來研究固液比、發(fā)酵溫度、接種量、發(fā)酵時間對銀杏黃酮提取得率的影響。

表1 正交試驗的因素與水平Table 1 The factors and levels of orthogonal experiment

2 結(jié)果與討論

2.1 種齡對提取得率的影響

將不同培養(yǎng)時間的種子液轉(zhuǎn)入到發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，測定黃酮提取得率，見圖1。

圖1 種齡對提取得率的影響Fig.1 The effect of seed age on extraction yield

由圖1可知，隨著種子培養(yǎng)時間的延長，提取得率明顯上升，當(dāng)種子培養(yǎng)時間足夠長后，提取得率又開始下降，因此，24 h為種子的最佳培養(yǎng)時間。

2.2 不同固液比對提取得率的影響

在上述種子培養(yǎng)時間的基礎(chǔ)上，考察不同固液比對提取得率的影響，見圖2。

圖2 固液比對提取得率的影響Fig.2 The effect of solid-liquid ratio on extraction yield

由圖2可知，固液比小于5∶100 (g/mL)，提取得率隨固液比的增大而增加，當(dāng)固液比為5∶100 (g/mL)時，提取得率達(dá)到最大值。當(dāng)固液比超過5∶100 (g/mL)時，提取得率有下降趨勢。當(dāng)銀杏葉比例太小時，銀杏葉中果膠類物質(zhì)的濃度未能使酶達(dá)到飽和，抑制果膠酶的作用，導(dǎo)致提取得率低。而當(dāng)銀杏葉比例太大時，酶含量相對較低，致使銀杏葉細(xì)胞壁和細(xì)胞間存在的果膠類物質(zhì)未被降解完全，同時溶劑量少，阻礙了黃酮類物質(zhì)進(jìn)一步溶出。

2.3 不同接種量對提取得率的影響

基于以上優(yōu)化條件，考察不同接種量對提取得率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 接種量對提取得率的影響Fig.3 The effect of inoculation amount on extraction yield

由圖3可知，在一定范圍內(nèi)，隨著接種量的增加，提取得率增加，接種量12%時，提取得率最高。接種量過少則菌體增長緩慢，代謝果膠酶不足，導(dǎo)致提取得率低；接種量過多使菌體生長速度過快，培養(yǎng)基營養(yǎng)相對不足，導(dǎo)致菌體提前衰老自溶，產(chǎn)酶量下降，影響提取得率。

2.4 不同發(fā)酵溫度對提取得率的影響

基于以上優(yōu)化條件，考察不同發(fā)酵溫度對提取得率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 發(fā)酵溫度對提取得率的影響Fig.4 The effect of fermentation temperature on extraction yield

由圖4可知，提取得率隨著發(fā)酵溫度的增加呈先升高后降低的趨勢。適宜的發(fā)酵溫度不僅可以促進(jìn)多粘類芽孢桿菌的生長及代謝，同時還能增大酶活[18]，促進(jìn)果膠類物質(zhì)的降解，提高提取得率，當(dāng)發(fā)酵溫度達(dá)到35 ℃時，提取率達(dá)到最大值。

2.5 不同發(fā)酵時間對提取得率的影響

基于以上優(yōu)化條件，考察不同時間對提取得率的影響，結(jié)果見圖5。

隨著發(fā)酵時間的延長，提取得率增加，當(dāng)發(fā)酵至28 h時，提取得率最高；隨著時間的繼續(xù)延長，銀杏黃酮提取得率逐漸降低。這是因為開始階段，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，代謝產(chǎn)物果膠酶不斷累積且與底物充分反應(yīng)，破壞細(xì)胞壁，使得銀杏葉中的黃酮不斷浸出，提取得率提高。在28 h后，黃酮已基本釋放出來，沒有再繼續(xù)延長發(fā)酵時間的必要。

圖5 發(fā)酵時間對提取得率的影響Fig.5 The effect of fermentation time on extraction yield

2.6 正交試驗

基于上述單因素試驗，選取種子培養(yǎng)時間為24 h，考察固液比、接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間對銀杏黃酮提取得率的影響，結(jié)果見表2。

表2 正交試驗結(jié)果與分析Table 2 The results of orthogonal experiment

通過對表2的極差分析，得到銀杏黃酮提取的最佳工藝條件為A2B1C2D2，即固液比5∶100 (g/mL)、接種量10%、發(fā)酵溫度35 ℃、發(fā)酵時間28 h。4個因素對銀杏黃酮提取得率的影響為固液比>發(fā)酵時間>發(fā)酵溫度>接種量。在上述提取銀杏黃酮的最佳條件下進(jìn)行試驗，得到銀杏黃酮提取得率為4.34%。

采用直接浸提技術(shù)，得到銀杏黃酮提取得率為1.09%。多粘類芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)生的果膠酶使植物細(xì)胞間的果膠質(zhì)降解，促進(jìn)細(xì)胞從組織中分離，同時還可以水解細(xì)胞壁中的果膠類物質(zhì)，破除細(xì)胞壁[19]。提取液在搖床中不斷振蕩，也可明顯促進(jìn)黃酮類物質(zhì)的釋放。該方法不需要復(fù)雜的酶分離提純操作，降低了生產(chǎn)成本，有利于經(jīng)濟(jì)效益的提高。因此，微生物破壁法對于黃酮類物質(zhì)的提取行之有效。

3 結(jié)論

利用多粘類芽孢桿菌發(fā)酵法提取銀杏葉中的黃酮。最佳提取條件為：種齡24 h，固液比5∶100 (g/mL)，接種量10%，發(fā)酵溫度35 ℃和發(fā)酵時間28 h時提取得率較高，銀杏黃酮提取得率為4.34%，相比直接浸提的提取率1.09%，較大提高了銀杏黃酮的提取得率，為銀杏葉中黃酮類物質(zhì)的高效提取提供了試驗依據(jù)。