張一江，張利芳，曹文紅，谷瑩蕾

(1.華北理工大學 輕工學院，河北 唐山 063000；2.廣東海洋大學 食品科技學院，廣東 湛江 524088)

藍圓鰺是我國重要的經(jīng)濟魚類之一，又稱紅背圓鰺、棍子魚、刺巴魚、巴浪魚、黃占、池魚、池仔等，含有人體所需的多種氨基酸、維生素以及錳、鐵、鋅等豐富的微量元素，是一種優(yōu)質(zhì)的動物性蛋白魚類，但藍圓鰺產(chǎn)地為我國的南海、東海和黃海，因其生產(chǎn)高峰期為南方夏季，肉質(zhì)極易腐敗變質(zhì)，其加工利用水平較低，屬于低值魚類[1]。近年來，隨著生物質(zhì)資源的深度開發(fā)與利用，國內(nèi)外不少學者利用外加酶法生產(chǎn)水解魚蛋白，成為低值魚高值化利用的重要研究方向[2-6]，因此，研究藍圓鰺的酶解技術(shù)與工藝對合理利用藍圓鰺，提高其附加值具有重要意義。

目前，人們對采用外加酶法酶解藍圓鰺魚肉蛋白方面進行了一些積極和有益的探索，肖安風、張靜等均對藍圓鯵蛋白的酶解方式和工藝參數(shù)進行了不同角度的研究與分析[7-8]。本文在前人研究基礎上，運用木瓜蛋白酶、風味蛋白酶以及復合酶對藍圓鰺蛋白的酶解工藝進行了較詳細的研究，以期優(yōu)化酶解藍圓鰺蛋白的工藝條件，提高藍圓鰺的水解度，拓展藍圓鰺蛋白產(chǎn)品的利用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

木瓜蛋白酶(BR)、風味蛋白酶(BR)：諾維信天津公司；藍圓鰺：購于湛江東風生鮮市場，經(jīng)粉碎處理后保存于-18 ℃冷庫備用；HCl、HCHO、CuSO4、K2SO4、NaOH、H2SO4等：均為分析純。

1.2 儀器與設備

A-88型組織搗碎勻漿機 北京桑翌實驗儀器研究所；電磁爐 九陽股份有限公司；PHS-25型pH計 上海精密科學儀器有限公司；H1650R型冷凍高速離心機 金壇市新航儀器廠；UX2200H電子分析天平 日本SHIMADZU公司；HH-S型恒溫水浴鍋 上海新諾儀器設備有限公司；HYP-1004型四孔消化爐、101-1型電熱鼓風干燥箱 上海浦予工業(yè)科技有限公司；BS110S型電子天平 南創(chuàng)電子有限公司；ST20H3型蒸鍋 湛江霞山沃爾瑪超市；凱氏定氮裝置(實驗室組裝) 上海祎鴻分析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 藍圓鰺魚肉蛋白氮含量的測定

凱式定氮法[9]：按照王啟軍著的《食品分析實驗》規(guī)定的方法操作。

取樣：稱取0.3 g經(jīng)絞碎的藍圓鰺魚肉。

分析結(jié)果計算公式:

式中：c表示鹽酸標準溶液的濃度，mol/L；V1表示滴定樣品吸收液時消耗鹽酸標準溶液體積，mL；V2表示滴定空白吸收液時消耗鹽酸標準溶液體積，mL；M表示N2的摩爾質(zhì)量，14 g/mol；m表示樣品的質(zhì)量，g。

1.3.2 加酶量對藍圓鰺酶解效果影響的測定[10]

1.3.2.1 水解液的制備

首先將凍藏的經(jīng)粉碎的藍圓鰺解凍，然后分10組實驗并編號，每組實驗分別準確稱取50 g 藍圓鰺按1∶2 加水放置于250 mL的燒杯中，在55 ℃中預熱成漿，用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)體系pH值為6.0；其中5組分別添加0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的木瓜蛋白酶進行酶解，另外5組分別添加0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的風味蛋白酶進行酶解，反應時間2 h，然后加熱使酶失活(100 ℃，10 min)，離心15 min(4000 r/min)，收集上清液即為水解液。

1.3.2.2 水解液氨基態(tài)氮含量的測定

甲醛滴定法[11]：按照王永華著的《食品分析》規(guī)定的方法操作。

取樣：量取1 mL水解液。

分析結(jié)果計算公式 ：

式中：c表示NaOH標準溶液的濃度，mol/L；V1表示用中性紅作指示劑時消耗NaOH標準溶液的體積，mL；V2表示用百里酚酞作指示劑時消耗NaOH標準溶液的體積，mL；0.014表示 N2的毫摩爾質(zhì)量，g/mmol；M表示水解液總重，g；m表示2 mL水解液重，g。

此公式中的氨基態(tài)氮含量是指50 g魚肉水解后的水解液氨基態(tài)氮的總含量。

實驗數(shù)據(jù)進行3次測量，取其平均值(下同)。

1.3.3 溫度對藍圓鰺酶解效果影響的測定[12]

1.3.3.1 水解液的制備

首先將凍藏的經(jīng)粉碎的藍圓鰺解凍，然后分8組實驗并編號，每組實驗分別準確稱取50 g 藍圓鰺按1∶2加水放置于250 mL的燒杯中，其中2組在45 ℃中預熱成漿，2組在50 ℃中預熱成漿，2組在55 ℃中預熱成漿，2組在60 ℃中預熱成漿，再用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)體系pH值為6.0；然后在其中互不相同溫度的4組中分別添加1.5%的木瓜蛋白酶，另外4組分別添加1.5%的風味蛋白酶，酶解反應時間2 h，然后加熱使酶失活(100 ℃，10 min)，離心15 min(4000 r/min)，收集上清液即為水解液。

1.3.3.2 水解液氨基態(tài)氮含量的測定

按上述方法測定。

1.3.4 pH對藍圓鰺酶解效果影響的測定[13]

1.3.4.1 水解液的制備

首先將凍藏的經(jīng)粉碎的藍圓鰺解凍，然后分8組實驗并編號，每組實驗分別準確稱取50 g藍圓鰺按1∶2 加水放置于250 mL燒杯中，在55 ℃中預熱成漿，用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)體系pH值至5.5，6.0，6.5，7.0(各2組)；然后在其中互不相同pH的4組中分別添加1.5%的木瓜蛋白酶，另外4組分別添加1.5%的風味蛋白酶，酶解反應時間2 h，然后加熱使酶失活(100 ℃，10 min)，離心15 min(4000 r/min)，收集上清液即為水解液。

1.3.4.2 水解液氨基態(tài)氮含量的測定

按上述方法測定。

1.3.5 風味蛋白酶酶解工藝條件的正交優(yōu)化[14]

1.3.5.1 水解液的制備

首先將凍藏的經(jīng)粉碎的藍圓鰺解凍，然后分9組實驗并編號，每組實驗分別準確稱取50 g藍圓鰺按1∶2 加水放置于250 mL的燒杯中，然后各組的實驗溫度、pH、加酶量按下面正交實驗表進行設定，反應時間2 h，然后加熱使酶失活(100 ℃，10 min)，離心15 min(4000 r/min)，收集上清液即為水解液。

1.3.5.2 水解液氨基態(tài)氮含量的測定

按上述方法測定。

1.3.6 木瓜蛋白酶酶解工藝條件的正交優(yōu)化

1.3.6.1 水解液的制備

首先將凍藏的經(jīng)粉碎的藍圓鰺解凍，然后分9組實驗并編號，每組實驗分別準確稱取50 g藍圓鰺 按1∶2加水放置于250 mL的燒杯中，然后各組的實驗溫度、pH、加酶量按下面正交實驗表進行設定，反應時間2 h，然后加熱使酶失活(100 ℃，10 min)，離心15 min(4000 r/min)，收集上清液即為水解液。

1.3.6.2 水解液氨基態(tài)氮含量的測定

按上述方法測定。

1.3.7 風味蛋白酶和木瓜蛋白酶的單酶酶解最佳時間的測定[15]

1.3.7.1 水解液制備

首先將凍藏的經(jīng)粉碎的藍圓鰺解凍，然后分10組實驗并編號，每組實驗分別準確稱取50 g藍圓鰺按1∶2加水放置于250 mL的燒杯中，在55 ℃中預熱成漿，用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)體系pH值，其中5組pH調(diào)節(jié)至6.0，再向這5組中分別添加1.5%的木瓜蛋白酶進行酶解；另外5組pH調(diào)節(jié)至6.5，再向其中分別添加1.5%風味蛋白酶進行酶解；上述10組實驗中不同pH的2組反應2 h,不同pH的2組反應4 h、不同pH的2組反應6 h、不同pH的2組反應7 h、不同pH的2組反應8 h，然后加熱使酶失活(100 ℃，10 min)，離心15 min(4000 r/min)，收集上清液即為水解液。

1.3.7.2 水解液氨基態(tài)氮含量的測定

按上述方法測定。

1.3.7.3 水解度的測定

1.3.8 復合方案設計方法

1.3.8.1 水解液制備

水解液制備方法如上，制備條件見表1。

表1 水解液制備條件設計Table 1 The design of preparation conditions of hydrolysate

1.3.8.2 水解液氨基態(tài)氮含量的測定

按上述方法測定。

1.3.8.3 水解度的測定

2 結(jié)果與分析

2.1 藍圓鰺魚肉蛋白氮含量的測定結(jié)果

本次實驗所用藍圓鰺的平均重量為71.37 g/條，藍圓鰺魚肉中蛋白氮含量的測定結(jié)果見表2，最終測定其總蛋白含量為17.31%，蛋白氮含量為2.77 g/100 g。同其他人研究得出的藍圓鰺蛋白質(zhì)含量為18%比較接近，實驗結(jié)果在相對誤差范圍內(nèi)，說明結(jié)果是可靠的，偏低的原因是凱氏定氮過程比較難控制。此外，從數(shù)據(jù)可以看出藍圓鰺蛋白質(zhì)含量并不是很高。

表2 蛋白氮含量的測定結(jié)果Table 2 The determination results of protein nitrogen content

2.2 加酶量對藍圓鰺酶解效果影響的測定結(jié)果

木瓜蛋白酶和風味蛋白酶添加量對酶解藍圓鰺蛋白的影響結(jié)果見圖1。

圖1 加酶量對水解效果的影響Fig.1 The effects of enzyme additive amount on hydrolysis effect

由圖1可知，當酶濃度低于2.0%時，水解液氨基態(tài)氮含量隨酶濃度升高而逐漸增大；當酶濃度高于2.0%時，氨基態(tài)氮含量增加的幅度減緩，水解度相對較小。綜合考慮經(jīng)濟因素，確定酶的最適濃度為1.5%左右。此外，在相同條件下，木瓜蛋白酶的酶解程度大于風味蛋白酶，從而也初步驗證了后面復合酶解方案需以木瓜蛋白酶為主酶進行藍圓鰺酶解的結(jié)論。

2.3 溫度對藍圓鰺酶解效果影響的測定結(jié)果

溫度對木瓜蛋白酶和風味蛋白酶酶解藍圓鰺蛋白的影響結(jié)果見圖2。

圖2 溫度對水解效果的影響Fig.2 The effects of temperature on hydrolysis effect

由圖2可知，溫度對酶的水解反應速度影響比較大，隨溫度升高，水解液氨基態(tài)氮含量逐漸增多，酶的活性逐漸增大，但溫度達到55 ℃后，水解液氨基態(tài)氮含量隨溫度升高開始下降，酶逐漸變性而失去活力，藍圓鰺蛋白水解速度迅速下降。從而可以得出，當溫度達到一個值時，酶活性最大，水解度也最大。由圖2可知，最佳水解溫度在55 ℃左右。同樣，在相同條件下，木瓜蛋白酶的水解效果好于風味蛋白酶。

2.4 pH對藍圓鰺酶解效果影響的測定結(jié)果

pH對木瓜蛋白酶和風味蛋白酶酶解藍圓鰺蛋白的影響結(jié)果見圖3。

圖3 pH對水解效果的影響Fig.3 The effects of pH values on hydrolysis effect

針對pH值對于兩種蛋白酶的影響是否有顯著差異進行了T檢驗，雙尾檢驗的P=0.214>0.05，說明pH值對兩種蛋白酶之間沒有顯著差異。由圖3可知，酶解過程中過高或過低的pH值均會影響蛋白酶的活性，降低水解度。在峰值之前，隨著pH值增大，酶的活性增大，水解程度增大；達到峰值時，水解效果最好，在峰值之后，隨著pH增大，酶的活性逐漸減小，水解程度越來越小。因此可得風味蛋白酶酶解藍圓鰺蛋白的最適pH為6.5左右，木瓜蛋白酶的最適pH為6.0左右。由于兩種酶的最適pH不一樣，所以在設計復合方案時，要考慮不同pH下同樣先后順序添加酶對水解度的影響。

2.5 風味蛋白酶酶解工藝條件的正交優(yōu)化結(jié)果

風味蛋白酶的正交優(yōu)化結(jié)果見表3和表4。

表3 正交實驗因素水平表Table 3 The factors and levels of orthogonal experiment

表4 正交優(yōu)化結(jié)果Table 4 The results of orthogonal optimization

由表3和表4可知，溫度、加酶量和pH對風味蛋白酶酶解效果影響大小為：酶解溫度>加酶量>pH。結(jié)合圖1實驗結(jié)果得出當加酶量在1.5%～2.0%區(qū)間，氨基態(tài)氮含量變化率僅為0.7%，綜合考慮，選用加酶量1.5%。風味蛋白酶的最佳酶解條件為55 ℃，pH 6.5，加酶量1.5%。

2.6 木瓜蛋白酶酶解工藝條件的正交優(yōu)化結(jié)果

木瓜蛋白酶的正交優(yōu)化結(jié)果見表5和表6。

表5 正交實驗因素水平表Table 5 The factors and levels of orthogonal experiment

表6 正交優(yōu)化結(jié)果Table 6 The results of orthogonal optimization

由表5和表6可知，各因素對木瓜蛋白酶酶解效果影響大小順序為：酶解溫度>加酶量>pH。得出的結(jié)果和風味蛋白酶乃至所有酶的結(jié)果是一致的，所以這驗證了實驗的正確性。結(jié)合圖1實驗結(jié)果得出當加酶量在1.5%～2.0%區(qū)間，氨基態(tài)氮含量變化率僅為1.3%，綜合考慮，選用加酶量1.5%。因此木瓜蛋白酶的最佳酶解條件為55 ℃，pH 6.0，加酶量1.5%。

2.7 風味蛋白酶和木瓜蛋白酶的單酶酶解最佳時間的測定結(jié)果

酶解最佳時間的測定結(jié)果見圖4。

圖4 最佳酶解時間Fig.4 The optimal enzymolysis time

由圖4可知，酶解時間越長，水解液氨基態(tài)氮含量越高，酶解效果越好，但當酶解時間大于7 h時，曲線趨于平穩(wěn)，酶解效果隨酶解時間增加幾乎不變，因此酶解藍圓鰺蛋白的最佳時間是7 h。在此條件下，風味蛋白酶酶解藍圓鰺的水解度為25.6%，木瓜蛋白酶酶解藍圓鰺的水解度為28.8%。另外，由圖4可知，同是最佳酶解條件下，相同酶解時間，木瓜蛋白酶的酶解效果優(yōu)于風味蛋白酶，方案4得出的以木瓜蛋白酶為主酶的結(jié)果又一次得到了驗證，證明實驗的可靠性。

2.8 復合方案設計結(jié)果

兩種酶復合酶解方案(固液比1∶2)設計結(jié)果見表7。

表7 各復合方案酶解結(jié)果Table 7 The enzymolysis results of each compound enzyme scheme

由表7以及前面實驗結(jié)果可得，復合酶解方案4的效果不僅優(yōu)于其他3個方案，而且優(yōu)于單酶酶解的效果，這說明設計復合酶解方案的必要性和可行性；此外，實驗結(jié)果也表明方案4的水解液澄清度、色澤以及魚腥味等都優(yōu)于其他3個方案，所以最終水解方案4最佳，確定復合方案為：在溫度55 ℃、pH 6.0、固液比1∶2的條件下，先加入1.5%的木瓜蛋白酶水解7 h后，再加入1.5%的風味蛋白酶水解3 h，此條件下水解度為33.1%。

2.9 單酶以及復合酶酶解液的風味、色澤和澄清度

單酶以及復合酶酶解液的風味、色澤和澄清度結(jié)果見表8。

表8 風味、色澤、澄清度結(jié)果Table 8 The results of flavor, color and clarity

由表8可知，方案4較其他風味、色澤以及澄清度都有非常大的改善，上面結(jié)論得到了驗證。

2.10 結(jié)果分析與比較討論

單因素實驗中加酶量、酶解溫度和pH 3個因素的影響結(jié)果曲線的趨勢是完全符合事實的，同其他類似研究一樣；同樣正交實驗盡管數(shù)據(jù)同其他類似研究數(shù)據(jù)不同，但是比較相近，而且各個因素對酶解結(jié)果影響大小順序是一樣的：酶解溫度>加酶量>pH，各因素的最適條件也是相同或者非常接近，出現(xiàn)這樣的結(jié)果主要是由于溫度對酶的活性影響效果最為顯著，加酶量的多少關(guān)系到底物與酶的比例；酶解時間的確定也是如此。但是本實驗得出的酶解溫度、加酶量、pH以及酶解時間的最適條件只是相對的，沒有再做實驗，所以最終的酶解條件不是最佳條件，只是其比較接近的值。本實驗同其他類似研究最大的優(yōu)點就是做了復合酶解方案設計，得到的實驗方案不管從酶解的水解度，還是水解液的色澤、風味以及澄清度方面考慮，都有很大的改善，這樣可以減少酶解時間，提高酶解效果，為魚露的快速發(fā)酵提供了更有利的參考。

3 結(jié)論

本實驗首先根據(jù)查閱的相關(guān)文獻，通過單因素實驗研究了影響風味蛋白酶和木瓜蛋白酶水解藍圓鰺蛋白的各種因素，得到了各個因素的大致最適范圍，在此基礎上利用正交實驗對兩種酶酶解工藝條件進行了優(yōu)化設計，得到了木瓜蛋白酶水解藍圓鰺蛋白的最適條件為：55 ℃、pH 6.0、酶濃度1.5%、水解時間7 h，在此條件下藍圓鰺蛋白水解度為28.8%；風味蛋白酶水解藍圓鰺蛋白的最適條件為：55 ℃、pH 6.5、酶濃度1.5%、水解時間7 h，在此條件下藍圓鰺蛋白水解度為25.6%。

為了進一步提高藍圓鰺蛋白的水解程度，又在正交實驗的基礎上，設計了以上兩種酶的幾組不同復合作用方案，結(jié)果表明：在溫度55 ℃、pH 6.0、固液比1∶2的條件下，先加入1.5%木瓜蛋白酶水解7 h后，再加入1.5%風味蛋白酶水解3 h，水解度可以達到33.1%。本實驗得出的最佳工藝條件不僅增大了藍圓鰺的水解度，而且水解液的風味、色澤以及澄清度都有了很好的改善。