盧雯瑩，秦素研，戴晉，劉美茹，袁曼曼

（漯河市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河南 漯河 462300）

為應(yīng)對生態(tài)環(huán)境不斷惡化的嚴峻考驗，植物在生長發(fā)育時逐漸形成了復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)調(diào)控。研究表明，WRKY 家族轉(zhuǎn)錄因子能與靶基因啟動子中的順式作用元件W-box（TTGACC/T） 特異性結(jié)合，從而調(diào)控目的基因的表達，并廣泛參與植物生長發(fā)育、非生物脅迫等應(yīng)激響應(yīng)。了解植物WRKY 轉(zhuǎn)錄因子及其參與非生物脅迫調(diào)控機制，對未來植物抗逆相關(guān)基因挖掘、抗逆遺傳育種等具有實際意義。對WRKY 轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)、分類及其在部分非生物脅迫響應(yīng)中的研究進展進行綜述，旨為相關(guān)研究提供信息參考。

1 WRKY 轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)及分類

WRKY 蛋白屬于WRKY 家族，是植物中較大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一[1]，最早從甜土豆中分離出來[2]，隨后又在擬南芥、水稻和大豆等多種植物中被發(fā)現(xiàn)和報道。WRKY 蛋白的名字來源于它們都含有1 個長度為60 個氨基酸左右的WRKY 結(jié)構(gòu)域，其N 端含保守的WRKYGQK 序列[1]，C 端含有1 個Cx4-5Cx22-23HxH（簡稱C2H2） 或者Cx7Cx23HxH（簡稱C2HC） 的鋅指結(jié)構(gòu)[3]。WRKYGQK 序列是WRKY 結(jié)構(gòu)域的核心序列，其突變往往導(dǎo)致WRKY 蛋白結(jié)合DNA 的活性降低甚至喪失[4]。WRKY 結(jié)構(gòu)域的首個溶液結(jié)構(gòu)主要由4 條β 折疊構(gòu)成，伴隨有Cys/His 殘基組成的鋅指結(jié)構(gòu)[5]。WRKYGQK 序列主要位于N 端的β 折疊上，使得該序列可以部分從蛋白表面伸出，進而有助于WRKY 蛋白與DNA 結(jié)合。Duan 等[6]報道的擬南芥WRKY1 蛋白晶體結(jié)構(gòu)得到了相似的WRKY 結(jié)構(gòu)域，只是其有1 個額外的β 折疊，使該結(jié)構(gòu)域看起來更明顯。此外，WRKY 的結(jié)構(gòu)與NAC 和GCM 轉(zhuǎn)錄因子的DNA 結(jié)合域相似，表明WRKY 與NAC 和GCM 在進化上有很大的相關(guān)性[5，7]。WRKY 與GCM 鋅指結(jié)構(gòu)相似，但NAC缺乏WRKY 的核心序列WRKYGQK。這些相似結(jié)構(gòu)是否具有其他作用，目前仍不清楚[5]。

WRKY 結(jié)構(gòu)域和鋅指結(jié)構(gòu)是WRKY 蛋白的2 個重要組成部分，根據(jù)二者數(shù)量或類型的不同，可以將其分為3 個組（Group）：GroupⅠ含有2 個WRKY 結(jié)構(gòu)域，Group Ⅱ和Group Ⅲ僅含有1 個；GroupⅠ和GroupⅡ含有相同的C2H2鋅指結(jié)構(gòu)，而Group Ⅲ含有特殊的C2HC 鋅指結(jié)構(gòu)；根據(jù)氨基酸序列的不同，Group Ⅱ可以進一步分為Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd 和Ⅱe 5 個亞組[1]。系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明，高等植物的WRKY家族可以更精確地分為GroupsⅠ、Ⅱa+Ⅱb、Ⅱd+Ⅱe和GroupsⅢ[8，9]。

凝膠阻滯、酵母單雜交、共轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)錄激活等試驗均證明WRKY 轉(zhuǎn)錄因子可以與下游基因啟動子中的一些保守序列結(jié)合，這些序列被稱為W-box，通常包含TTGACC/T 結(jié)構(gòu)[1，10]。盡管幾乎所有報道的WRKY蛋白都能結(jié)合到相同的核心序列（TGAC） 上，但WRKY 轉(zhuǎn)錄因子又是如何特異性地分辨各自靶基因的啟動子呢？Ciolkowski 等[11]利用凝膠阻滯試驗研究了擬南芥5 種WRKY 蛋白后發(fā)現(xiàn)，除W-box 的核心序列是WRKY 蛋白結(jié)合所必需的之外，W-box 的側(cè)翼序列也能部分決定WRKY 的偏好性，如AtWRKY6、AtWRKY11 對5’端毗鄰鳥嘌呤殘基的W-box 具有 很高的親和性，而AtWRKY26、AtWRKY38 和AtWRKY43 對5’端毗鄰腺嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶殘基的W-box 具有很高的親和性。CTGACC 和TTGACA 不能被5 種WRKY 蛋白結(jié)合，表明類W-box序列并不具有W-box 序列的功能，W-box 元件應(yīng)為TTGACC/T 結(jié)構(gòu)[7]。生物信息學(xué)分析和功能研究均發(fā)現(xiàn)在脅迫誘導(dǎo)型啟動子中含有多個W-box 元件[12]，串聯(lián)的W-box 能夠增強WRKY 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的效率，如多個W-box 對PcWRKY1 的轉(zhuǎn)錄效果具有協(xié)同性[13]，大麥HvWRKY38 需要3 個毗鄰的W-box 才能有效地結(jié)合[14]。但也有少數(shù)研究發(fā)現(xiàn)，WRKY 轉(zhuǎn)錄因子可以結(jié)合非W-box 元件來發(fā)揮功能。OsWRKY13 既可以結(jié)合Wbox 序列，又可以結(jié)合PRE4 元件（TGCGCTT）[15]；HvWRKY46 能同時結(jié)合W-box 和SURE 元件（TAAA GATTACTAATAGGAA）[16]；NtWRKY12 可以結(jié)合糖響應(yīng)類似元件（TTTTCCAC），而不能結(jié)合W-box[17]。

2 WRKY 在非生物脅迫中的作用

早期的轉(zhuǎn)錄組分析揭示出WRKY 轉(zhuǎn)錄因子可能參與到非生物脅迫反應(yīng)中，近年來，越來越多的研究證實了WRKY 在植物響應(yīng)非生物脅迫中扮演著重要角色。響應(yīng)熱激的特異啟動子HSP101 過表達水稻的WRKY11 基因研究發(fā)現(xiàn)，OsWRKY11 能夠增強水稻的耐旱性，表現(xiàn)為減緩葉片萎蔫，提高綠色部位的存活率[18]。過表達OsWRKY45 和OsWRKY72 能夠增強水稻對鹽和干旱的耐受性[19，20]。PEG、NaCl 和ABA 處理能夠增強OsWRKY08 的轉(zhuǎn)錄活性，從而通過正調(diào)控2種不依賴于ABA 的脅迫響應(yīng)基因AtCOR47 和AtRD21 的表達來提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的滲透脅迫[20]。另外，過表達GmWRKY54 也能夠增強植物對鹽脅迫和干旱脅迫的耐性，而GmWRKY13 的過表達則會增加對鹽脅迫和甘露醇脅迫的敏感性[21]。NaCl 和鹽脅迫能夠強烈地誘導(dǎo)TcWRKY53 的表達，且過表達TcWRKY53 會導(dǎo)致2 種ERF 家族基因NtERF5 和NtERFBP-1 的表達下調(diào)[22]。ABA、干旱和NaCl 處理能夠增強擬南芥2 個緊密相關(guān)的WRKY 轉(zhuǎn)錄因子AtWRKY25 和AtWRKY33 的轉(zhuǎn)錄，且Atwrky33 的無效突變體和Atwrky25Atwrky33 雙突變體都表現(xiàn)出對NaCl 敏感性增強，而過表達AtWRKY25 和AtWRKY33 其中1 個都可以增強擬南芥對NaCl 的耐受性[23]。

研究表明，WRKY 蛋白在ABA 信號途徑中可能扮演激活子或者抑制子的角色，LtWRKY21 可以正調(diào)控ABA 相關(guān)基因的表達，瞬時表達試驗分析表明，對于同一個ABA 誘導(dǎo)型啟動子，OsWRKY24 和Os WRKY45 起抑制作用，而OsWRKY72 和OsWRKY77則起激活作用[24]。Atwrky2 的T-DNA 插入突變表明，AtWRKY2 負反饋調(diào)控ABA 介導(dǎo)的種子萌發(fā)[25]。AtWRKY57 和AtWRKY63 均參與擬南芥對干旱和ABA的響應(yīng)，其中，AtWRKY57 直接調(diào)控ABA 合成基因的表達，而AtWRKY63 則直接調(diào)控ABA 下游基因ABF2 的表達[26，27]。Shang 等[28]發(fā)現(xiàn)3 類WRKY 蛋白（AtWRKY18、AtWRKY40、AtWRKY60） 在種子萌發(fā)的過程中負調(diào)控ABA 信號，進一步的遺傳分析表明AtWRKY40 是3 類WRKY 轉(zhuǎn)錄因子中主要的負調(diào)控因子，能夠通過結(jié)合啟動子下游的W-Box 序列而直接抑制幾種重要的ABA 響應(yīng)基因AtABF4、AtABI4、AtABI5、AtDREB1A、AtMYB2 和AtRAB18 的表達；高濃度的ABA 能夠從細胞核中招募AtWRKY40 到細胞質(zhì)中，使AtWRKY40 與ABA 相互作用，從而促進ABA 響應(yīng)基因的表達。單突變體、雙突變體、三突變體以及過表達試驗表明，AtWRKY18 和AtWRKY60 對于敏感型植株起正調(diào)控作用，從而抑制種子萌發(fā)和根系生長，同時它們也能夠增強植株對鹽脅迫和滲透脅迫的敏感性[29]。這些結(jié)果表明，WRKY 轉(zhuǎn)錄因子在ABA 信號途徑中扮演重要的角色。

此外，越來越多的研究表明，WRKY 蛋白在植物營養(yǎng)脅迫中具有重要作用。AtWRKY6 同時參與擬南芥缺磷和缺硼的響應(yīng)，AtWRKY6 能夠抑制磷轉(zhuǎn)運基因PHO1 的表達，在低磷情況下，AtWRKY6 蛋白的穩(wěn)定性降低，導(dǎo)致其與PHO1 啟動子的結(jié)合減弱，進而使PHO1 的表達下調(diào)[30]。Castrillo 等[31]進一步研究發(fā)現(xiàn)AtWRKY6 能夠減少對砷的吸收，從而降低轉(zhuǎn)座子的活性。此外，AtWRKY75 也參與缺磷的響應(yīng)，并且能夠調(diào)控擬南芥根系的發(fā)育[32]。

3 展望

WRKY 轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子家族，自1994年發(fā)現(xiàn)第1 個WRKY 蛋白以來，借助遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的研究方法，WRKY 蛋白的研究取得了豐碩成果。迄今為止的報道表明，WRKY 不僅參與植物的生長發(fā)育，而且還能夠參與多種非生物脅迫反應(yīng)，如干旱、冷害、高溫、高鹽、營養(yǎng)匱乏等。絕大多數(shù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子可以響應(yīng)溫度脅迫，以此避免溫度變化帶給植物的傷害；通過參與ABA 介導(dǎo)的信號通路提高植物對干旱脅迫的耐受性[33]。除此之外，它還積極響應(yīng)鹽脅迫和氧化脅迫等非生物脅迫[34]。WRKY 轉(zhuǎn)錄因子主要通過ABA、JA 和SA 等信號通過來調(diào)控植物的非生物脅迫反應(yīng)，但其復(fù)雜的調(diào)控機制及相關(guān)信號通路之間的作用關(guān)系尚未完全清楚。通過對WRKY 家族的研究，采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對作物進行改良，將有助于提高植物的抗逆性，幫助篩選抗逆性強的優(yōu)良品種。