劉迎雪，趙瀅，張寶香，楊義明，范書田，李昌禹，王月，許培磊，秦紅艷，路文鵬

（中國農業(yè)科學院特產研究所，吉林 長春130112）

早在100多年前人們就發(fā)現(xiàn)了內生菌，但內生菌并不像病原菌一樣使寄主植物表現(xiàn)癥狀。因此，長期以來對內生菌的研究一直被忽略，直到20世紀30年代，由于牲畜食用了感染內生真菌的牧草導致中毒，給畜牧業(yè)造成重大損失，對植物內生菌的研究才引起重視。大量研究發(fā)現(xiàn)，許多內生菌與植物互利共生，內生菌作為一種新的微生物資源受到了廣泛的關注[1]。

內生菌一詞“endophyte”最早于1866年由德國科學家Barry[2]提出，為了區(qū)別生長在植物表面的表生菌（epiphyte），將內生菌定義為在植物體內生活的微生物。在這100多年的時間里有多位科學家對內生菌的概念重新定義[3]。目前較公認的植物內生菌的概念為，在生活史的某一階段或全部階段，生活于健康植物的各種組織和器官內部的微生物，被侵染的寄主植物不表現(xiàn)出病癥，可以通過組織學方法或從嚴格表面消毒的植物組織中分離或從植物內直接擴增出微生物DNA的方法來證明其內生[4]。內生菌包括內生細菌、內生真菌和內生放線菌。本文主要綜述了植物內生細菌的來源及生物學功能研究進展情況。

每一種被研究的植物中都發(fā)現(xiàn)了內生細菌，它們在宿主植物的內部組織中定居，并能形成一系列不同的關系，包括共生、互利、共棲和營養(yǎng)共生[5]。大多數內生細菌似乎起源于根際或葉圈，然而，有些可能通過種子傳播。內生細菌能促進植物的生長和提高植物的產量，并可作為生物調節(jié)劑。內生細菌還可以通過產生一系列的自然產物來提高宿主的抗逆性，這些天然產物在醫(yī)藥、農業(yè)或工業(yè)領域有潛在用途。為了更全面地了解內生細菌的來源和生物學功能，本文綜述了近年文獻，總結了內生細菌研究領域取得的成果，以期為北方特色抗寒漿果功能菌株的挖掘提供理論依據。

1 植物內生細菌的來源途徑

植物是復雜的內生細菌群落的寄主，這些細菌在植物的地上和地下組織中均有分布。在植物組織內生活的細菌，每一代都可以從種子垂直遷移，也可以從環(huán)境中水平獲得。了解內生細菌的傳播途徑和模式，將有利于農業(yè)和自然生態(tài)系統(tǒng)中植物-內生細菌相互作用的研究。

1.1 垂直傳播

垂直傳播即內生細菌從親本到子代的垂直遷移，內生細菌在植物-內生細菌共生體中起著不可或缺的作用，例如廣泛研究的細菌和昆蟲之間的營養(yǎng)共生體[5]。目前研究較多的垂直傳播方式包括種子遷移和花粉遷移。

1.1.1 種子垂直遷移種子微生物組越來越引起人們的興趣。在已對表面消毒的各物種種子中都發(fā)現(xiàn)了細菌，包括植物玉米、大米、刀豆、南瓜和葡萄等[6-8]。在種子的不同部位，包括外殼、胚乳和胚組織中都檢測到了細菌[9]。Truyens等[10]綜述了種子內生細菌的研究，發(fā)現(xiàn)種子中的細菌往往屬于特定的屬，特別是芽孢桿菌（Bacillusanthracis）和假單胞菌（Pseudomonas），但也有類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）、微球菌屬（Micrococcus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、泛菌屬（Pantoea）和不動桿菌屬（Acinetobacter）。許多研究表明，一些種子內生細菌具有有益的寄主效應，例如在惡劣的環(huán)境條件下，種子內生細菌通過巖石風化和固定大氣氮提供無機養(yǎng)分，可以促進植物萌發(fā)和生長[11]。考慮到這些有益的特性，可以推測，一些植物可能已經與細菌形成了共生關系，這種共生關系通過種子垂直傳播，從而確保了有益共生關系的持續(xù)傳播，類似于植物與內生

真菌之間的防御共生關系[12]。Miller等[13]描述的植物-細菌共生體證明了專性垂直傳播。在被子植物紫金牛屬（Ardisia）、大沙葉屬（Pavetta）與九節(jié)屬（Psychotria）等中存在的葉結球固氮伯克霍氏共生體存在于每一營養(yǎng)枝梢，并在每一片新葉上定殖，這些細菌還可以轉移到花的生長點，隨后進入發(fā)育胚珠的胚囊，然后到達胚珠的上胚軸，最終到達幼苗的莖尖。另外，Liu等[14]報道了特定內生細菌種在水稻和玉米中世代存在的連續(xù)性，這支持了垂直傳播的觀點。

1.1.2 花粉垂直傳播內生菌進入種子的一種可能途徑是通過雄配子。Frnkranz等[15]在不同植物種類的花粉內部發(fā)現(xiàn)了細菌。如果花粉內或花粉上的細菌起源于植物內部，它們向種子和幼苗的轉移構成垂直傳播。Ambika等[16]對從來源于地中海白松（Pinus halepensis）、意大利五針松（P.pinea）和土耳其松樹（P.brutia）表面滅菌的花粉中分離到的內生腸桿菌屬（Enterobacter）研究表明，所分離到的細菌是來自受精的胚珠，這種采用分離方式獲得內生細菌證明了內生細菌是來源于花粉內部，表明松樹花粉中的腸桿菌是通過垂直遷移的。

1.2 水平傳播

1.2.1 土壤中的細菌通過種子際和根際進入植物定殖土壤被認為是內生細菌最重要的接種源[17]，是地下和地上植物微生物群落的庫。種子際是土壤微生物定殖的開始部位之一，種子際微生物是圍繞萌發(fā)種子的短暫的微生物動態(tài)區(qū)，在種子際細菌可以對萌發(fā)產生有益的影響[18]。種子以糖、蛋白質和脂肪酸的形式分泌出碳，這些化合物是微生物的能量來源，它們能改變種子周圍土壤的細菌組成[19]?？赡苓@種在植物早期通過選擇形成的生物際間關系上所建立的互利作用是非常重要的[8]。根際（即圍繞根部的毫米范圍的土壤）充滿了細菌，這些細菌可以促進宿主的生長發(fā)育，幫助獲取營養(yǎng)，抵御病菌，誘導系統(tǒng)抗性，協(xié)助抵抗非生物脅迫，如有毒污染物或干旱[20]。根分泌物質吸引土壤微生物，增加植物根附近的微生物種群[21]。此外，植物根系通過影響土壤pH值、土壤結構和周圍土壤的供氧量來調節(jié)其微生物群[22]。Philippot等[23]研究發(fā)現(xiàn)，植物在整個生命過程中，專門“招募”有助于適應壓力的微生物。在幾項研究中，細菌被定位在側根出芽位置和根尖，這表明，細菌通過根部的裂縫和根尖進入[24]。Compant等[25]用帶有綠色熒光蛋白（GFP）標記的Burkholderia sp.strain PsJN接種釀酒葡萄vinifera，PsJN從根表面開始，然后到根內部組織，最后在節(jié)間和葉片的木質部導管中發(fā)生了按時間順序的定殖。以上研究都支持了細菌經過水平傳播通過根定殖于植物內部的結論。

1.2.2 環(huán)境中的細菌通過葉片的氣生組織和花器官進入植物定殖研究人員認為，葉際是地球上最普遍的微生物棲息地之一[26]。大氣中有許多懸浮微生物，這些微生物是具有活性的[27]，懸浮微生物中的細菌尤其豐富，其濃度為104~106個細胞/m3[28]。懸浮微生物的形成被認為是細菌在全球和大陸尺度上擴散和遷移的主要機制[29]。特別是空氣中的塵埃，被認為是微生物的主要運輸方式[30]。病原菌通過植物的氣孔進入的途徑已被研究，而內生細菌通過植物的氣孔進入途徑的研究報道較少。對病原菌的研究表明，病原菌可以通過氣孔、皮孔和水孔進入植物的葉片和莖，但氣孔數量最多，是進入植物地上部分內部的主要途徑[31]。事實上，植物識別并排斥特定的細菌進入它們的氣孔，而這些細菌發(fā)展出了對抗這些反應的機制，這就提出了一個問題：是否允許共生菌或有益的葉際菌進入氣孔，并可能將其作為內生菌在地上部分進行定殖。對葉片表面和內部群落組成菌的重疊研究表明，葉片表面菌落代表了某些葉片內生菌定殖的初始階段[32]。對菠蘿的內生細菌進入途徑進行研究發(fā)現(xiàn)，固氮內生細菌Herbaspirillum seropedicae可以進入菠蘿的氣孔中，細菌聚集在毛狀體、表皮細胞壁交界處和氣孔復合體附近，然后通過氣孔下腔進入葉肉細胞間隙[33]。

以上研究證明了大氣中的細菌從葉片、莖進入植物組織成為內生細菌，但也有研究表明，植物內生細菌也可以通過植物組織遷移到植物表面，進入大氣中。Lindemann等[34]對大氣中存活細菌的定量研究發(fā)現(xiàn)，植物冠層上的細菌濃度遠遠高于土壤中的細菌濃度，這項研究表明，植物冠層是空氣傳播細菌的主要來源。Bowers等[35]對農田、郊區(qū)和森林上空空氣傳播菌群的描述指出，土壤和植物表面是近地表大氣中部分細菌的來源。還有研究表明，種子傳播的細菌通過發(fā)芽的幼苗接種到植物表面[36]。

除了氣生組織，細菌進入植物的另一個途徑是花器官。在花器官的表面寄生著不同的細菌群落[37]。通過分離培養(yǎng)的方法已經描述了花粉、花蜜、花瓣、雌蕊、果實中的細菌[38]。通過研究證明，花表面的細菌和葉表面的細菌來源相同，都是來自于大氣、懸浮顆粒、風、雨的飛濺、傳粉昆蟲[39]。在對蘋果花相關微生物群落的研究結果認為，風可能是細菌傳遞到花的媒介[40]。關于細菌通過環(huán)境在花中定殖還未有直接證據，但通過梨火疫病病原體（Erwinia amylovora）感染蘋果花，穿透花組織的研究[41]可以間接說明，細菌是可以通過花器官進入植物的。

2 內生細菌的生物學功能

2.1 促進宿主植物生長

內生細菌對植物生長的促進作用主要是通過產生赤霉素、生長素、細胞分裂素等植物激素，直接促進植物生長；通過菌株的固氮、溶磷作用[42]、鐵素體的產生[43]等，間接促進植物生長；通過誘導植物產生耐受物質，提高植物的抗逆性從而促進植物的正常生長。

2.1.1 內生細菌的固氮、溶磷作用氮是植物生長發(fā)育所必需的大量元素之一，氮的使用在很大程度上決定了植物的產量。近年來，為滿足不同作物對氮素的需求，植物內生細菌固氮已成為提高作物產量的一個重要途徑。固氮作用涉及宿主植物的適應性，特別是在缺氧環(huán)境下的適應性[44]。植物通過固氮獲得養(yǎng)分，固氮是菌株促進植物生長的一種機制[45]。這一特征在根瘤菌中得到了很好的驗證，目前發(fā)現(xiàn)了許多有固氮功能的菌株，如芽孢桿菌屬（Bacillus）、草螺菌屬（Herbaspirillum）、固氮螺菌屬（Azospirillum）及產堿菌屬（Alcaligenes）等[46]。

利用溶磷微生物作為單一肥料或與其他生物肥料混合施用，可提高作物對養(yǎng)分的準確吸收，減少磷肥的過量施用。研究表明，不同的細菌種類，特別是根際定殖細菌，具有產生葡萄糖酸、溶解不溶性磷酸鹽和促進植物生長的能力[47]。內生細菌將可溶性磷酸鹽提供給植物，作為交換，它們主要從植物根部獲取細菌生長所必需的糖和有機酸。研究表明，給農作物接種溶磷微生物，在不顯著降低作物產量的情況下，磷肥施用量可降低50%[48]。

2.1.2 內生細菌通過產生植物生長調節(jié)物質促進植物生長促進植物生長的內生細菌通過產生刺激植物生長的化學物質來發(fā)揮它的功能。這些化學物質包括赤霉素、生長素、細胞分裂素和揮發(fā)類化學物質。目前證明假單胞菌屬（Pseudomonas）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、固氮菌屬（Azotobacter）、腸桿菌屬（Enterobacter）和固氮螺菌屬（Azospirillum）等屬的一些菌株可以產生乙烯、生長素和細胞分裂素，并通過這些生長調節(jié)物質來改變植物的生長發(fā)育[49]。Egamberdieva[50]研究發(fā)現(xiàn)，在鹽或干旱脅迫下，細菌產生的生長素對植物的促生效應依賴于生長素濃度，且不同的植物對生長素濃度效應也不一樣；除了細菌生長素的數量外，生長素對植物發(fā)育的促進作用還與宿主本身的敏感性有關。產生長素菌株對小麥[51]、黑醋栗和酸櫻桃[52]的影響研究證明了植物對細菌反應的品種特異性。Persello-Cartieaux等[53]研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥的生長素抗性突變體對硫維菌根定殖不敏感，而同樣的接種在野生型植物上會引起根系形態(tài)的變化。寄主植物還可以積極參與調控微生物生長素的生物合成?？茖W家們不但證實了內生細菌產生促生長物質，還明確了其作用途徑，經過研究發(fā)現(xiàn)大多數有益內生細菌通過吲哚丙酮酸（IPyA）途徑產生生長素，且這一觀點認為，吲哚-3-乙酰胺（IAM）途徑與發(fā)病機制有關，這一觀點通過Pa突變體的產生得到了支持[54]。Lpez-Bucio等[55]對根際細菌進行研究發(fā)現(xiàn)菌株Bacillus megatarium UMCV1可以產生細胞分裂素，該細菌通過抑制主根生長、增加側根形成和根毛長度來促進植物生長。

2.2 增強宿主植物抗逆性

內生細菌能通過產生次生代謝物質而增強植物的抗逆性，這引起了越來越多研究者的重視。Chen等[56]將接種內生細菌的棉花再接種棉花枯萎病菌，發(fā)現(xiàn)接種了內生細菌的棉花感病癥狀明顯比不接種的植株癥狀減輕。王萬能等[57]從煙草根莖部分離所得的118菌株對煙草有誘導抗病作用，防治煙草黑脛病效果很好。目前很多有益菌株已被開發(fā)成植物生防菌劑[58]。對內生細菌的研究雖然有很多，但關于內生細菌與宿主植物的互作機制并沒有完全明確，原因是內生細菌與植物的互作關系十分復雜，而且內生細菌長期生活在植物體內，生存環(huán)境穩(wěn)定，在研究過程中很難模擬這種環(huán)境模型，而在活體植物上直接開展研究又很難實現(xiàn)。總結近些年關于內生細菌提高植物抗逆性的研究結果包括以下幾方面。

2.2.1 分泌抗菌物質目前研究的內生細菌產生的抗菌物質主要是抗生素，抗生素是一種低濃度即能殺死病菌的異源小分子化合物。植物內生細菌產生的抗生素類物質主要有藤黃綠膿菌素（Plt）、2，4-二乙酰間苯三酚（2，4-DAPG）、硝吡咯菌素（PRN）和吩嗪-1-羧酸（PCA）等。2，4-二乙酰間苯三酚是假單胞菌屬（Pseudomonas）產生的一種酚類化合物，它具有抗病毒、抗病原真菌及其它細菌的作用[59]。Beck等[60]從小麥體內獲得的一株粘質沙雷菌（Serratia marcescens）能夠產生Fusaricidin A-D抗菌活性物質，這種物質提高了小麥的抗病性。Diby等[61]研究發(fā)現(xiàn)，植物內生細菌產生的氰化氫可抑制辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsicii）的生長。Mohamed等[62]研究細菌菌株GB03和IN937a對植物的抗逆性作用發(fā)現(xiàn)，菌株是通過產生揮發(fā)性有機化合物（VOC）來激發(fā)植物的防御反應，同時，內生細菌通過釋放2，3-丁酮、3-羥基丁酮等易揮發(fā)性有機化合物來誘導植物產生系統(tǒng)抗性。

2.2.2 與病原菌競爭生態(tài)位和營養(yǎng)物質近些年的研究發(fā)現(xiàn)內生細菌侵入寄主的途徑、方式等與病原菌相似，有些內生細菌進入植物后優(yōu)先占據了病原菌的侵入位點，競爭了生態(tài)位，導致病原菌無法進入植物體內。例如，Bacon等[63]研究玉米內生細菌發(fā)現(xiàn)，內生枯草芽孢桿菌與病原菌串珠鏈孢菌（Fusarium moniliforme Sheldon）有相同的生態(tài)位點，該菌能在玉米內迅速定殖和繁殖，有效降低了病原菌串珠鏈孢菌的侵入及其毒素的積累。

2.2.3 誘導宿主植物產生系統(tǒng)抗性（induced systemic resistance，ISR）除了直接互作而引起的生防作用外，植物內生細菌還可以誘導寄生植物產生系統(tǒng)抗性（ISR）來抑制病原菌的侵襲和生長。一些內生細菌能誘導植物在細胞間隙積累酚類、醌類物質，從而構成植物體內機械和化學屏障，阻止病菌的侵入。Van Peer等[64]通過研究證實了內生菌誘導植物產生的系統(tǒng)抗性是通過結構方面的改變產生的，而與病程相關蛋白無關。Benhamon等[65]將內生細菌Bacillus pumilus strain接種豌豆然后再接種病菌，結果在病菌的侵入點發(fā)現(xiàn)了大量沉積的鞣質和酚類物質，細胞壁加厚，病菌被限制在外皮層和木栓層之間不能進入。這些都充分證明了內生細菌能夠通過誘導植物組織結構的改變，阻止病菌的侵入，從而提高植物抗性。

2.3 生物修復作用

肥料和含重金屬的化學農藥長期與大量施用，導致不能分解物質大量殘留，不僅污染環(huán)境，而且導致農產品重金屬離子和農藥殘留超標。從植物體內分離獲得對農藥、化肥和重金屬具有降解作用的內生細菌，因其具有能在植物體內定殖的特點，對降解農產品內農藥、肥料、重金屬的殘留具有更大的優(yōu)勢。目前利用內生細菌對土壤中農藥殘留和化肥降解方面的研究報道很多，如假單胞菌可以降解土壤中殘留的除草劑阿特拉津[66]；枯草芽孢桿菌可以分解土壤中難溶的磷酸鹽，使之容易被植物吸收[67]。Germaine等[68]從楊樹中分離到的內生細菌POPHV6（P.putida strain）可以降解土壤中的除草劑2，4-二氯苯氧基乙酸，從而增加植物的修復能力。Van等[69]從楊樹中分離到的內生細菌BJ001（Methylobacterium populi）和Bu61（B.cepacia）分別能降解甲烷和甲苯。

2.4 產生有價值的代謝產物

植物產生的生物活性化合物具有很強的生理活性。然而，它們的生產也存在著各種各樣的問題，例如植物生長慢、有效成分低等生產力水平下降的問題。內生細菌在受控的環(huán)境條件下產生初級和次級代謝物，可以保證活性化合物均勻、高質量及最大效率的生產[70]。大量研究發(fā)現(xiàn)利用植物內生細菌可以生產有較高藥用潛力的材料。內生細菌合成的次生代謝物和酶等生物活性化合物被廣泛用于食品和食品補充劑、生物燃料、生物農藥等一些產品的制造中[71]。植物內生細菌可產生豐富多樣的具有生物活性的代謝產物，按其功能主要分為抗生素類、抗腫瘤物質和殺蟲劑類等。

2.4.1 產生抗生素抗生素是微生物作為次生代謝產物產生的天然化合物，可以殺滅或抑制其他微生物。自1928年Alexander Fleming發(fā)現(xiàn)第1例抗生素（青霉素）至今，人們對抗生素的研究和利用已經超過近百年的歷史，它們在20世紀傳染病治療中發(fā)揮了重要作用。到目前為止，制藥工業(yè)主要針對的是來自土壤微生物、細菌或真菌的藥物。而細菌、放線菌尤其值得注意，因為它們是產生抗生素的主要來源，80%的抗生素來源于鏈霉菌[72]。從鏈霉菌分離物中至少發(fā)現(xiàn)了7 000種不同的次生代謝物[73]。大多數內生細菌可產生不同種類的抗生素。Ecomycin、Pseudomycins和Kakadumycins是內生菌產生的一些新型抗生素[74]。黃褐假單胞菌是許多禾本科植物葉子上的附生或內生菌，它產生的氯霉素可用于治療呼吸道和尿道感染，皮膚、眼睛和腸道感染。研究人員從木犀草內生鏈霉菌中分離出一種新的萘醌類抗生素阿齊霉素；從蛇藤中分離的內生菌NRRL30562產生了新的綠藻螺旋霉素，其對多種人類疾病、植物病原真菌和細菌具有廣譜活性；NRRL30566是從一株蕨葉銀樺（Grevillea pteridifolia）葉片中分離得到的內生鏈霉菌，其化學性質與棘霉素類似[75]。2.4.2產生抗菌化合物內生細菌產生的抗菌代謝產物是具有生物活性的天然化合物[76]。內生細菌已經形成了一種通過產生次生代謝物來控制病原入侵的抗性機制[77]。許多內生細菌產生的抗菌化合物屬于多個結構類別，如多肽、生物堿、類固醇、奎寧、萜類、酚類和黃酮類[78]。Zhao等[79]從攀西高原的26種藥用植物中分離到大量的內生放線菌，其抗菌譜極廣，是新型生物活性化合物的重要來源。Hong-Thao等[80]從柑橘果實中分離得到的內生鏈霉菌TQR12-4具有抑菌活性，抑制了試驗病原菌毛豆炭疽?。–olletotrichum truncatum）、白地霉菌（Geotrichum candidum）、黃瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum）的生長。

2.4.3 產生抗腫瘤物質自從1993年Stierle等[81]首次從太平洋紅豆杉中分離出1株產紫杉醇的內生真菌Taxomyces andreanae以來，從內生細菌中分離提取高效抗癌活性物質成為了科學家們研究的熱點，他們投入了大量的精力和物力來開展這方面的研究，并取得了一些重大的進展。一些內生細菌產生的生物活性化合物已被確定為抗癌劑[82]。Jung等[83]從紅辣椒葉片中分離到內生細菌EML-CAP3，該菌株具有較強的抗血管生成活性；該菌株產生親脂肽，抑制人臍靜脈內皮細胞的增殖，并在腫瘤進展中表現(xiàn)出抗血管生成的潛力。眾所周知，人參以其具有抗癌特性的人參皂苷而聞名。Gao等[84]將從人參中分離的內生細菌進行回接，發(fā)現(xiàn)能促進人參皂苷的產量。Chen等[85]通過研究首次發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌是抗腫瘤胞外多糖的來源，作為一種新的抗癌劑，它是一種具有很高治療價值的天然產物。

3 結語與展望

隨著對內生細菌研究的不斷深入，利用其獨特的生物活性物質合成特性的潛力也日益增大。目前，對北方藥用植物如人參、五味子和刺五加等內生細菌的研究不多，在特色漿果山葡萄、軟棗獼猴桃和藍靛果等方面內生細菌的研究更是鮮有報道。細菌內生菌可以為寄主植物提供多種益處，尤其是促進生長和保護寄主植物免受病原體的侵害[86]。生長在北方的植物，其生長環(huán)境寒冷、干燥，尤其是野生株生長的環(huán)境更為惡劣，其內部的微生態(tài)系統(tǒng)對植株生長起著重要的作用。未來可對北方特色藥用植物和漿果內生細菌進行深入研究，挖掘功能菌株，開發(fā)生物農藥、肥料及生物活性化合物，這對特色產業(yè)的發(fā)展具有重要的意義。