郝宇鵬，謝艷，周英杰，柴旭斌，禚漢杰

(1.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙；2.河南省洛陽正骨醫(yī)院 河南省骨科醫(yī)院， 河南 洛陽)

0 引言

生長板是一種動態(tài)的高度分化的軟骨結構，在軟骨內(nèi)骨化和骨的形成中發(fā)揮著重要的作用。軟骨細胞存在于關節(jié)軟骨中，具有增殖活性，負責分泌II 型膠原和其它類型的膠原以及非膠原的細胞外基質大分子。成軟骨細胞的增殖和分化與脊椎動物骨架的發(fā)育有著密切的關系。軟骨細胞能分泌和響應一系列的生長因子，包括IGF-1 和IL1。體外培養(yǎng)的軟骨細胞是研究軟骨修復和關節(jié)炎病理的有用模型。

軟骨細胞培養(yǎng)一般取材于關節(jié)軟骨，肋軟骨，恥骨聯(lián)合等部位。利用大鼠生長板軟骨細胞進行培養(yǎng)取材容易，但是存在由一個部位取材太少，不容易達到培養(yǎng)所需細胞用量的問題。而且股骨和脛骨是關于生長板相關疾病的重要發(fā)病部位，所以本文通過取大鼠股骨和脛骨關節(jié)軟骨，探索一種簡便、可靠的生長板軟骨細胞分離培養(yǎng)及鑒定方法，為骨關節(jié)疾病體外研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑與儀器

1.1.1 主要試劑

iCell 原代軟骨細胞培養(yǎng)體系( 賽百慷( 上海) 生物技術股份有限公司，貨號：Primed-icell-020)；胎牛血清( 美國Gibco 公司，貨號：1414426)；0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA，美國Gibco 公司，貨號：1734858)；0.1% Ⅱ型膠原酶(Gibco公司，貨號17101015)；多聚甲醛( 北京索萊寶科技有限公司，貨 號：P1110)；4'，6- 二 脒 基-2- 苯 基 吲 哚(DAPI)( 北 京索萊寶科技有限公司，貨號：C0060)；Triton X-100( 北京索萊寶科技有限公司，貨號：T8200)；山羊血清( 北京索萊寶科技有限公司，貨號：SL038)；兔Ⅱ型膠原一抗( 武漢三鷹生物技術有限公司，貨號：15943-1-AP)；Alexa Fluor 594 標記的山羊抗兔IgG(H+L)熒光二抗(武漢三鷹生物技術有限公司，貨號：SA00006-4)；Fluoromount-G 熒光封片劑( 美國SourthernBiotech 公司，貨號：0100-01)。

1.1.2 主要儀器

生物安全柜(濟南鑫貝西生物技術有限公司，型號：BSC-1500 ⅡA2-X)；CO2細胞培養(yǎng)箱( 上海博迅實業(yè)有限公司，型號BC-J160S：)；熒光倒置顯微鏡(日本Nikon 公司，型號：DS-Ri2)；高速冷凍離心機( 美國Thermo Fisher 公司，型號：Multifuge ×1R)；電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司，型號：DHG-9123A)；電熱恒溫震蕩水槽(上海精宏實驗設備有限公司，型號：DK-2B)；T25 細胞培養(yǎng)瓶(Coming 公司，型號：430639)；血球計數(shù)板(德國Marienfeld 公司，型號：Neubauer improved)；24 孔板專用細胞爬片(北京索萊寶科技有限公司，型號：YA0350)；細胞培養(yǎng)孔板(上海臥宏生物科技有限公司，型號WHB-24)。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠生長板軟骨細胞分離

圖1 大鼠股骨、脛骨生長板軟骨細胞分離與培養(yǎng)

培養(yǎng)取2 只4 周齡SD 大鼠，斷頸法處死，浸入75%乙醇中10 分鐘進行消毒。無菌條件下用滅菌消毒后的眼科剪分別取出股骨及脛骨，去除肌肉及骨膜組織，分離生長板軟骨。將收集的軟骨組織置于超凈工作臺中，剔除軟骨組織上的結締組織，清除沾染的血液污漬，置于培養(yǎng)基中，然后剪碎成約1mm3大小的碎塊，使用無菌磷酸緩沖鹽(PBS)清洗數(shù)次后加入0.1% Ⅱ型膠原酶與0.25% 胰蛋白酶20mL，置于37℃恒溫震蕩水槽中震蕩消化1.5h，中和，置離心機中1000r/min離心5min，棄上清液，收集組織，再加入0.1% Ⅱ型膠原酶20mL，于4℃過夜消化。取過夜消化的細胞懸液，吹打若干次，然后通過100μm 篩網(wǎng)過濾，收集濾液移入離心管中，置離心機中1000r/min 離心5min，棄上清液，細胞沉淀重懸于軟骨細胞培養(yǎng)基中，按5×105個細胞/瓶的密度接種于25cm2的培養(yǎng)瓶中，在37℃、5%CO2、飽和濕度95%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基每3 d 更換1 次。

1.2.2 軟骨細胞形態(tài)學

觀察在倒置相差顯微鏡下觀察培養(yǎng)的軟骨細胞的形態(tài)變化并拍照記錄。

1.2.3 繪制軟骨細胞生長曲線

將制備的軟骨細胞懸液接種于96 孔板中，作為實驗組?？瞻捉M以培養(yǎng)基代替細胞懸液，每孔0.2mL，每組設3 個復孔。收集第2 代細胞，調(diào)整細胞濃度為每孔5×104個細胞，總共8 塊板，置CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)，隔天換液，連續(xù)觀察8 天，24h 后開始計數(shù)，以后每隔24h 計數(shù)一次，每次取1 塊板，分別進行計數(shù)，計算每3 個復孔的平均值。連續(xù)計數(shù)8d。每日取一塊培養(yǎng)板，每孔加入MTT(5g/L)20uL37℃孵育4h 后棄培養(yǎng)液，加入DMSO 150U/孔，37℃溫浴10min。微量震蕩器震蕩培養(yǎng)板至結晶溶解，將空白對照調(diào)零，使用酶標儀490nm波長處測定光密度值(OD)值，以時間作為橫軸，光密度值作為縱軸繪制生長曲線。

1.2.4 軟骨細胞免疫熒光鑒定[1,2]

于24 孔板中放置3 片無菌蓋玻片，每孔加入培養(yǎng)基1mL，取分離獲得的生長板軟骨細胞，按2×104個/每孔的密度接種。培養(yǎng)過夜后將培養(yǎng)基吸出，PBS 清洗1 遍，加入4%多聚甲醛(PFA)于4℃固定30min，再用PBS 清洗3 次，每次5min。將蓋玻片除去水分，置于培養(yǎng)皿支撐物上，取50uL 破膜封閉液(0.5% Trition X-100 與PBS 1:1 混合，再加10%山羊血清)滴于防水膜上，蓋于玻片細胞面上透化2h；然后滴加50uL 兔Ⅱ型膠原一抗工作液(PBS 配置，一抗：PBS=1:100)，4℃孵育過夜，PBS 清洗3 次，每次5min；再滴加Alexa Fluor 594 標記的山羊抗兔IgG(H+L)熒光二抗工作液(PBS 配置，二抗：PBS=1:500)，室溫下避光孵育2h，PBS 清洗3 次，每次5min；最后滴加DAPI(DAPI:PBS=1:1000)染色5min，PBS 清洗3 次，每次5min 后，滴加Fluoromount-G 包埋，熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄。

2 結果

2.1 軟骨細胞形態(tài)倒置

相差顯微鏡下觀察，剛接種的軟骨細胞為小圓球形，懸浮在培養(yǎng)液中，且細胞的體積大小相似，折光性較強，隨著培養(yǎng)，軟骨細胞逐漸增大，胞核與核仁也逐漸清晰。培養(yǎng)2 天后細胞開始逐漸貼壁，形態(tài)多呈圓形或橢圓形增大，伸長形成偽足(圖2，A)。培養(yǎng)4 天后軟骨細胞呈扁平狀，不規(guī)則卵圓形或三角形，有成簇及重疊生長現(xiàn)象出現(xiàn)(圖2，B)。培養(yǎng)6 天后軟骨細胞90%融合形成單層，細胞形態(tài)不規(guī)則，呈多邊形，星形等，胞體豐富，胞漿均勻，相互密集連接呈“鋪路石”狀外觀(圖2，C)。3 代后細胞大多為長梭形，遮光性差。部分細胞由貼壁狀態(tài)脫落，懸浮于培養(yǎng)液中(圖2，D)。

圖2 生長板軟骨細胞形態(tài)變化

2.2 軟骨細胞生長曲線

細胞第1-3 天為生長潛伏期，第4-6 天為對數(shù)生長期，第6-7 天達到平臺期，從第7 天開始出現(xiàn)生長抑制現(xiàn)象。見圖3。

2.3 軟骨細胞免疫熒光鑒定結果

Ⅱ型膠原是軟骨細胞分泌的特異性膠原，可利用其免疫熒光對軟骨細胞進行鑒定。大鼠生長板軟骨細胞經(jīng)培養(yǎng)72小時后進行免疫熒光實驗，結果顯示，在熒光倒置相差顯微鏡下，細胞質被激發(fā)出清晰紅色熒光(圖4B)，細胞核經(jīng)DAPI染色后在不同波段熒光激發(fā)出藍色熒光(圖4，A)，表明分離培養(yǎng)的細胞表達特征性Ⅱ型膠原，符合軟骨細胞的生物學特征，證明本實驗方法能夠分離培養(yǎng)出純度較高的軟骨細胞，可供進一步實驗研究使用。

圖3 第2 代生長板軟骨細胞生長曲線圖

圖4 生長板軟骨細胞免疫熒光鑒定

3 討論

體外細胞實驗對細胞數(shù)量和細胞的功能活性要求都很高，但體外傳代培養(yǎng)軟骨細胞的分裂增殖能力有限，隨傳代次數(shù)的增加會出現(xiàn)去分化及生物學功能活性衰退。因此，以有限的供體活組織收獲盡可能多而活性高的原代細胞，降低其體外擴增，在組織工程的研究與臨床應用中都非常重要。

生長板軟骨由不含纖維血管組織，用酶把基質消化后就可分離出大量高純度的軟骨細胞[1]。分離軟骨細胞應用最多的是低質量濃度的胰蛋白酶和Ⅱ型膠原酶順序染色消化法。胰蛋白酶對軟骨細胞外周基質有較強的消化能力，可將大部分的蛋白多糖分解；Ⅱ型膠原酶可將膠原降解成低分子多肽短鏈物。本實驗中先使用胰蛋白酶聯(lián)合Ⅱ型膠原酶消化除去軟骨細胞基質及組織取材時可能帶入的雜質細胞，同時疏松軟骨顆粒的表面結構，利于膠原酶發(fā)揮作用，再使用Ⅱ型膠原酶消化過夜，使基質內(nèi)的膠原網(wǎng)架解離降解，隨后在機械的反復吹打下，便可分離出大量的軟骨細胞。

潘思年[4]、陳秋秋[5]等利用關節(jié)軟骨進行培養(yǎng)，需要多只2-3 周齡的大鼠，所需大鼠數(shù)量比較多時增加了實驗時間，降低了軟骨細胞的存活率。我們用4 周齡SD 大鼠，取股骨和脛骨軟骨細胞進行培養(yǎng)，僅需2 只大鼠即可，節(jié)約了試驗時間和軟骨細胞的存活率。

生長板軟骨細胞具有軟骨細胞的共同特點，即可以合成和分泌包括膠原蛋白及蛋白聚糖在內(nèi)的多種基質成分。膠原蛋白是關節(jié)軟骨的主要成分，其中以Ⅱ型膠原蛋白為主，占軟骨膠原總量的90%～95%，Ⅱ型膠原表達陽性是軟骨細胞的特征性標志[6]，可用于鑒定軟骨細胞。Alexa Fluor 染料為羅丹明或香豆素的衍生物，是一種含有活性基團的有機熒光染料，具有激發(fā)光譜窄、發(fā)射光譜寬、量子產(chǎn)率高、光穩(wěn)定性好，以及受溫度、pH 影響小等優(yōu)點[7]。與傳統(tǒng)的熒光團相比，Alexa Fluor 激發(fā)的熒光具有發(fā)光亮度更強，靈敏度更高，背景更低，因此更適合于拍照。本實驗選用Alexa Fluor 594 標記的山羊抗兔IgG(H+L)作為二抗，經(jīng)熒光激發(fā)后細胞呈現(xiàn)清晰紅色，證明了本實驗所培養(yǎng)的細胞為軟骨細胞。