鄭適澤 喬春燕 孟 琳 任飛龍李瑋柏 任春霞 陳雨蒙 孫宏晨

（1. 吉林省牙發(fā)育及頜骨重塑與再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室； 2. 吉林大學(xué)口腔醫(yī)院病理科；3. 吉林大學(xué)口腔醫(yī)院；4． 吉林大學(xué)口腔醫(yī)院牙周科，吉林 長(zhǎng)春 130021）

頭頸鱗狀細(xì)胞癌（HNSCC）指原發(fā)于口腔、咽喉等部位的鱗狀上皮細(xì)胞惡性腫瘤的總稱(chēng)。 在世界范圍內(nèi)，HNSCC 占所有新診斷癌癥的4%，5 年生存率低于50%。 HNSCC 的5 年生存率較低，原因包括早期診斷不明、治療效果欠佳及缺乏治療后監(jiān)測(cè)。 近50%的HNSCC 患者在初次診斷時(shí)出現(xiàn)淋巴結(jié)受累，預(yù)后不良[1-2]。 由于其解剖學(xué)特性，原發(fā)性和復(fù)發(fā)性HNSCC 的各項(xiàng)檢查難度較大。 目前診斷HNSCC所需的臨床檢查，如影像學(xué)檢查和組織活檢都受到腫瘤位置的阻礙，導(dǎo)致診斷延遲[3]。

近年來(lái)， 液體活檢成為診斷癌癥的輔助手段。它通過(guò)生物液體采樣，檢測(cè)多種對(duì)癌癥診斷和治療可能具有潛在作用的癌癥生物標(biāo)志物[4-6]。 cfDNA 作為新的腫瘤標(biāo)記物在癌癥診療中起重要作用。 與其他生物標(biāo)志物相比，cfDNA 易于分析， 并且包含特定的與腫瘤和轉(zhuǎn)移有關(guān)的改變， 例如單核苷酸突變、甲基化改變和拷貝數(shù)變異，因此受到廣泛研究。在癌癥患者中，含有腫瘤特異性序列改變的cfDNA被稱(chēng)為循環(huán)腫瘤DNA(circulating DNA，ctDNA)。 已有研究顯示，ctDNA 可能來(lái)自原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移腫瘤的基因組，并反映了腫瘤細(xì)胞的克隆性[7-8]。 此前有研究報(bào)道了cfDNA 在乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、結(jié)腸癌中的臨床應(yīng)用，而cfDNA 與HNSCC 之間關(guān)系，國(guó)內(nèi)還鮮有報(bào)道。 本文就cfDNA 在HNSCC 中的研究進(jìn)展做一綜述。

1 cfDNA 生物學(xué)特征

1.1 cfDNA 的來(lái)源

人體可以在多種狀態(tài)下產(chǎn)生cfDNA，如癌癥、運(yùn)動(dòng)、衰老、炎癥和免疫反應(yīng)等[9]。 關(guān)于cfDNA 的來(lái)源，目前有以下觀點(diǎn)。 ①壞死： 病理狀態(tài)下發(fā)生細(xì)胞壞死，細(xì)胞產(chǎn)能和再生能力喪失，細(xì)胞和細(xì)胞器溶脹，核染色質(zhì)結(jié)塊和非特異性消化， 繼而通過(guò)巨噬細(xì)胞對(duì)細(xì)胞碎片的消化作用，將DNA 片段釋放到血液中形成cfDNA[10-11]。 ②細(xì)胞凋亡：許多研究表明，細(xì)胞凋亡是正常組織和腫瘤產(chǎn)生cfDNA 的主要來(lái)源[12]。 其產(chǎn)生的機(jī)制可能是脫氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease，DNase）將染色體切割成長(zhǎng)度為160~180 bp 核小體片段的倍數(shù)，并將其釋放入血[13]。 ③細(xì)胞焦亡：細(xì)胞焦亡又稱(chēng)細(xì)胞炎性壞死，是依賴(lài)含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase 1,Caspase 1）的細(xì)胞程序性死亡。細(xì)胞發(fā)生焦亡時(shí)表現(xiàn)為細(xì)胞發(fā)生腫脹， 細(xì)胞膜上形成孔隙，使細(xì)胞膜失去完整性，釋放內(nèi)容物，引起炎癥反應(yīng)。 初始時(shí)細(xì)胞核位于細(xì)胞中央， 隨著形態(tài)學(xué)的改變，細(xì)胞核固縮，DNA 斷裂并釋放入血形成cfDNA[14-15]。 ④活細(xì)胞的釋放： 活細(xì)胞釋放的cfDNA 是由活細(xì)胞新合成的，通過(guò)與其他物質(zhì)復(fù)合，包裹在膜結(jié)構(gòu)中或黏附于細(xì)胞膜上，可免于核酸酶的降解[16]。 有研究報(bào)道，癌癥患者血液中的cfDNA 可能來(lái)源于“健康”細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞以及腫瘤微環(huán)境細(xì)胞，同時(shí)基質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞同樣成為了腫瘤相關(guān)cfDNA 的潛在來(lái)源[9,17]。

1.2 cfDNA 的結(jié)構(gòu)

1.2.1核小體 核小體長(zhǎng)度約為160~180 bp，凝膠電泳呈特征性梯形結(jié)構(gòu)。 細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，半胱天冬酶激活的DNase 和溶酶體DNase Ⅱ降解了染色體DNA，產(chǎn)生了核小體。 核小體由組蛋白八聚體和圍繞該蛋白復(fù)合物的雙鏈DNA 組成。 圍繞組蛋白八聚體螺旋纏繞， 長(zhǎng)為147 bp 的DNA 與長(zhǎng)為20~90 bp 的接頭DNA 相結(jié)合確保了核小體的結(jié)構(gòu)完整性，可保護(hù)DNA 免受循環(huán)系統(tǒng)中酶的降解[11]。

1.2.2微泡 微泡由1 種或幾種脂質(zhì)膜包裹著水室構(gòu)成，水室中含有細(xì)胞成分和分子結(jié)構(gòu)。 微泡的結(jié)構(gòu)包括：外泌體、微粒、凋亡小體，腫瘤狀態(tài)下這些微泡包含了腫瘤相關(guān)DNA。研究人員在癌癥患者血液中發(fā)現(xiàn)了由癌細(xì)胞產(chǎn)生的多種微泡，其含量顯著高于健康人[17-18]。 這些微泡具有轉(zhuǎn)化能力，構(gòu)成了cfDNA 的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)[19-20]。

2 cfDNA 的提取與檢測(cè)

2.1 樣品選擇

多種生物體液，如血液、淋巴液、尿液、唾液和腦脊液中均含有cfDNA[21]。 樣品類(lèi)型的選擇對(duì)檢測(cè)靈敏度有較大影響。檢測(cè)HNSCC 中的cfDNA 時(shí)，樣品通常選擇血液和唾液。 Wang 等[22]檢測(cè)了口腔癌患者血漿和唾液中的ctDNA，結(jié)果顯示將血漿和唾液的分析相結(jié)合，靈敏度達(dá)96%，高于單獨(dú)使用唾液或血漿的檢測(cè)結(jié)果。 然而提高檢測(cè)靈敏度需要滿足以下條件： 突變DNA 作為生物標(biāo)記物具有較高的特異性。 由于預(yù)期不出現(xiàn)假陽(yáng)性，因此可以對(duì)多種樣品進(jìn)行檢測(cè)， 在不影響特異性的情況下提高靈敏度[22]。

2.2 采樣方法

有研究人員使用D1000 ScreenTape 系統(tǒng)檢測(cè)口腔鱗狀細(xì)胞癌患者血漿中cfDNA 的平均濃度，結(jié)果為53.06 ng/mL[23]。 但先前研究報(bào)道的結(jié)果顯示，口咽鱗狀細(xì)胞癌的cfDNA 濃度為9.60 ng/mL[24]。 這種不相符可能是由于不同研究報(bào)道患者的不同、癌癥類(lèi)型的不同，以及血液樣本處理、血漿分離和存儲(chǔ)方式、DNA 定量方法的不同造成的。 一些因素可能影響cfDNA 的檢測(cè)，包括樣品保存時(shí)間、血樣的處理、DNA 的定量方法、患者的異質(zhì)性等。 因此，采血后應(yīng)立即對(duì)樣品進(jìn)行血漿分離， 避免血細(xì)胞DNA污染樣品。此外，在一個(gè)實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)采用標(biāo)準(zhǔn)方案集中處理cfDNA 的提取和定量，以限制定量偏差[25-27]。

2.3 檢測(cè)手段

近年來(lái)，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出多種用于cfDNA 檢測(cè)的技術(shù)，可以對(duì)cfDNA 從點(diǎn)突變水平到整個(gè)基因組水平進(jìn)行分析。

2.3.1 Sanger測(cè)序 Sanger 測(cè)序是檢測(cè)組織DNA突變的金標(biāo)準(zhǔn)。 在液體活檢中，Sanger 測(cè)序存在2 個(gè)問(wèn)題：①樣本中cfDNA 含量較低可能會(huì)影響目標(biāo)基因的測(cè)序結(jié)果。 ②當(dāng)樣本中腫瘤細(xì)胞含量較低時(shí)，Sanger 測(cè)序的靈敏度不足以檢測(cè)突變頻率低于20%的等位基因[28-29]。由于液體活檢中檢測(cè)的突變等位基因頻率范圍在0.1%~1.0%， 甚至更低， 使用Sanger 測(cè)序可能產(chǎn)生假陰性結(jié)果，影響治療方案的選擇[30]。

2.3.2定量PCR目前英國(guó)FDA 已批準(zhǔn)不能進(jìn)行組織活檢的非小細(xì)胞肺癌患者，可以通過(guò)定量PCR（quantitative PCR, qPCR）的液體活檢來(lái)檢測(cè)cfDNA中基因突變。 有學(xué)者使用TaqMan 探針比較qPCR、數(shù)字PCR （digital PCR, dPCR） 以及第二代測(cè)序（next-generation sequencing，NGS）的突變檢測(cè)能力，只有qPCR 檢測(cè)等位基因頻率閾值未達(dá)到1%，而待測(cè)等位基因通常出現(xiàn)頻率較低， 目前特異性PCR 可檢測(cè)的等位基因不足以滿足臨床需要[31-32]。此外， 商品試劑盒包含了基因的常見(jiàn)熱點(diǎn)突變，但并不全面。 并且由于qPCR 檢測(cè)的致癌突變可能不在所選突變范圍內(nèi)， 使用qPCR 檢測(cè)可能會(huì)遺漏40%~50%的陽(yáng)性患者[33-34]。

2.3.3數(shù)字PCR和微滴式數(shù)字PCR為了改善傳統(tǒng)qPCR 靈敏度較低的問(wèn)題， 研究人員嘗試了多種特異性等位基因測(cè)定法[35]。 數(shù)字PCR（digital PCR,dPCR）法用物理方式分離模板等位基因，然后進(jìn)行單個(gè)擴(kuò)增。 微滴式數(shù)字PCR （droplet digital PCR,ddPCR） 在傳統(tǒng)PCR 擴(kuò)增前對(duì)樣品進(jìn)行微滴化處理， 經(jīng)PCR 擴(kuò)增后對(duì)每個(gè)微滴信號(hào)進(jìn)行逐一分析。該分析法能絕對(duì)定量cfDNA 中野生型和突變型分子，可以檢測(cè)出頻率低至0.01%的等位基因[36-37]。 與qPCR 相比，dPCR 和ddPCR 進(jìn)行多重分析的能力較差[38]。 與NGS 相比，在測(cè)試單個(gè)突變時(shí)，dPCR 和ddPCR 相對(duì)便宜且循環(huán)時(shí)間短，但是由于其無(wú)法檢測(cè)未知突變，需要先測(cè)試突變基因[37]。 由于dPCR 僅需要少量的模板分子，單分子檢測(cè)對(duì)于分析血漿中數(shù)量有限的cfDNA 等位基因有較大優(yōu)勢(shì)[39]。 dPCR在單分子檢測(cè)方面具有高敏感性，需要設(shè)置恰當(dāng)?shù)臋z測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，仔細(xì)處理樣本和試劑，防止交叉污染[31]。

2.3.4第二代測(cè)序和大規(guī)模水平測(cè)序 第二代測(cè)序（NGS）理論上適用于所有患者，可以從頭識(shí)別分子變化，包括單核苷酸取代、結(jié)構(gòu)重排和拷貝數(shù)變異。盡管NGS 已經(jīng)成為分析腫瘤組織特征的常規(guī)方法，但它對(duì)ctDNA 診斷的敏感性仍然不理想[31]。 在一個(gè)概念驗(yàn)證性研究中， 使用FDA 批準(zhǔn)的Oncomine 靶向測(cè)序試劑盒， 檢測(cè)非小細(xì)胞型肺癌患者cfDNA 中表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）基因突變的敏感性，有效率僅為77%[40]。 為了克服這些問(wèn)題，研究人員開(kāi)發(fā)了敏感度更高的靶向和全基因組測(cè)序。靶向測(cè)序通過(guò)PCR 擴(kuò)增和雜交捕獲技術(shù)富集反復(fù)變化的基因座[41-42]。 與擴(kuò)增子測(cè)序不同，基于雜交的方法擴(kuò)增周期較短，并且可以檢測(cè)ctDNA 的重排。 與基于擴(kuò)增的方法相比，NGS 的缺點(diǎn)在于需要較多的cfDNA。 分子條形碼可以整合數(shù)字誤差抑制，將個(gè)體化深度測(cè)序分析方法（cancer personalized profiling by deep sequencing，CAPP-Seq）技術(shù)敏感性提高到0.000 25%突變等位基因的理論極限值。 因此可以使用分子條形碼技術(shù)抑制誤差，提高擴(kuò)增子測(cè)序方法的靈敏度[41]。

2.3.5全外顯子測(cè)序和全基因組測(cè)序 隨著技術(shù)的進(jìn)步，已有研究將全外顯子測(cè)序（whole exome sequencing，WES） 應(yīng) 用 于cfDNA 表 征 腫 瘤 分 子[43]。Murtaza 等[7]在研究中用WES 進(jìn)行疾病監(jiān)測(cè)，并在幾個(gè)實(shí)體腫瘤中檢測(cè)到與腫瘤進(jìn)展相關(guān)的耐藥突變。 盡管WES 可以全面檢測(cè)分子譜，但它的靈敏度有限。與靶向測(cè)序相比，WES 覆蓋率低，無(wú)法檢測(cè)到等位基因頻率低于5%的稀有突變。因此，基于WES的cfDNA 檢測(cè)適用于晚期腫瘤及cfDNA 含量增加的患者，但在縱向研究中，低頻率等位基因占主要突變時(shí)，其檢測(cè)效果較差。 盡管WES 可以檢測(cè)“司機(jī)突變”，但無(wú)法檢測(cè)“乘客突變”，在精準(zhǔn)醫(yī)療的應(yīng)用中，它可以提供的信息十分有限[44]。

3 cfDNA 的臨床應(yīng)用

目前，ctDNA 在HNSCC 中的應(yīng)用主要集中在以下2 個(gè)方面： ①作為評(píng)估腫瘤負(fù)荷的生物標(biāo)志物；②檢測(cè)腫瘤基因異質(zhì)性。 ctDNA 液體活檢作為一種無(wú)創(chuàng)檢查，有著重要研究?jī)r(jià)值，適用于高風(fēng)險(xiǎn)或治療前診斷不明確的患者， 例如治療方案存在爭(zhēng)議的癌前病變，嚴(yán)重的增生性病變，活檢可能遺漏的、潛在的惡性病變。 此外，某些HNSCC 患者局部轉(zhuǎn)移灶較小，無(wú)法通過(guò)組織活檢進(jìn)行采樣和檢測(cè)。 在治療后階段， 具有較高敏感性的ctDNA 可以作為生物標(biāo)志物，評(píng)估HNSCC 病變殘留或局部復(fù)發(fā)情況。

3.1 cfDNA 用于HNSCC 的診斷

cfDNA 檢測(cè)具有微創(chuàng)性,這一方法可能成為輔助組織活檢的新手段。 大量研究表明,cfDNA 水平的增高可能提示腫瘤的發(fā)生[45]。 Mazurek 等[24]通過(guò)qPCR分析了200 例HNSCC 患者的cfDNA 水平， 檢測(cè)人乳頭瘤病毒16 型 （human papillomavirus，HPV16）、HPV18，鼠類(lèi)肉瘤病毒癌基因（kirsten rat sarcoma viral oncogene,KRAS）和EGFR突變。 與對(duì)照組相比，HNSCC 患者的平均總DNA 水平較高， 但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 與其他HNSCC 患者相比，口咽鱗狀細(xì)胞癌患者的總cfDNA 含量更高。 研究人員還證明了ctDNA 濃度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、 分期和年齡之間存在顯著相關(guān)性，有14%的患者呈HPV 陽(yáng)性，其中大多數(shù)為HPV16 陽(yáng)性（96.4%），而未檢測(cè)到EGFR和KRAS突變。 然而這些結(jié)果表明， cfDNA 檢測(cè)可用于HPV陽(yáng)性HNSCC 的診斷[22]。

3.2 cfDNA 用于HNSCC 治療后監(jiān)測(cè)

Wang 等[22]利用安全測(cè)序系統(tǒng)（safe-sequencing system，Safe-SeqS） 檢測(cè)HNSCC 患者血漿和唾液樣本中ctDNA， 靈敏度達(dá)到96%。 研究人員對(duì)9 例HNSCC 患者血漿和唾液樣本進(jìn)行研究，在復(fù)發(fā)4 例患者中的3 例患者術(shù)后4~8 個(gè)月的樣本中檢測(cè)到了ctDNA，早于臨床證據(jù)19 個(gè)月，而在沒(méi)有復(fù)發(fā)患者中，未檢測(cè)到ctDNA[22]。 Chuang 等[46]收集了59 例HNSCC 患者的唾液沖洗液，cfDNA 呈HPV 陽(yáng)性的20 例中有4 例復(fù)發(fā)， 其中2 例治療后唾液沖洗液中的cfDNA 呈HPV 陽(yáng)性（敏感性=50%）；而在39 例HPV16 陰性患者和16 例未復(fù)發(fā)的HPV16 陽(yáng)性患者中，治療后唾液沖洗液中的cfDNA 均不顯示HPV16 陽(yáng)性（特異性=100%）。 Rave 等[47]通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)了70 例患者的cfDNA，TNM 分期為Ⅲ期或Ⅳ期的HNSCC 患者中，6 例血清DNA 呈HPV陽(yáng)性的患者中有4 例發(fā)生了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

Sun 等[48]報(bào)道，唾液沖洗液中具有組織金屬蛋白酶抑制因子3（tissue inhibitors of metalloproteinase 3, TIMP3）啟動(dòng)子超甲基化HNSCC 患者患者的局部復(fù)發(fā)生存率比無(wú)甲基化HNSCC 患者低。 在另一個(gè)隊(duì)列中，研究人員在患者治愈后6 個(gè)月時(shí)收集了唾液沖洗液樣本，其中檢測(cè)到TIMP3 甲基化患者的局部復(fù)發(fā)生存率較低[49]。 Schrock 等[50]檢測(cè)了HNSCC患者cfDNA 中矮小同源盒基因 （short stature homobox 2,SHOX2）、SEPT9基因甲基化水平， 證明cfDNA 甲基化水平與淋巴結(jié)受累和死亡風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，并且最早在臨床出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移前377 d 時(shí)， 可以檢測(cè)到患者cfDNA 甲基化水平升高。 這些研究證明了在液體活檢中， cfDNA 甲基化檢測(cè)可以用于治療后監(jiān)測(cè)[49]。

在另一項(xiàng)研究中，研究人員通過(guò)使用微衛(wèi)星標(biāo)記分析等位基因失衡，在超過(guò)50%的樣本中檢測(cè)到血清中ctDNA 等位基因失衡， 而血清DNA 的等位基因失衡與腫瘤分期之間存在相關(guān)性[51]。 以上研究都證明cfDNA 作為預(yù)測(cè)HNSCC 復(fù)發(fā)、 遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)志物，具有潛在研究?jī)r(jià)值。

3.3 cfDNA 用于HNSCC 耐藥性檢測(cè)

識(shí)別腫瘤驅(qū)動(dòng)突變和表觀遺傳修飾能力有助于實(shí)現(xiàn)靶向治療，改善患者預(yù)后[52]。 HNSCC 具有較大的腫瘤遺傳異質(zhì)性， 即腫瘤不同部位可能存在不同突變，導(dǎo)致不同腫瘤細(xì)胞的耐藥性不同。 組織活檢通常只檢測(cè)腫瘤的幾個(gè)部位， 檢測(cè)結(jié)果可能存在偏倚。 而cfDNA 是從全身腫瘤細(xì)胞中脫落的，可以檢測(cè)到多種耐藥基因[53]。有研究將腫瘤活檢與cfDNA 檢測(cè)相比較，在單次組織活檢未發(fā)現(xiàn)耐藥性改變的患者中，利用cfDNA 檢測(cè)到2/3 患者的耐藥性改變[54]。cfDNA 中分子變異的檢測(cè)已經(jīng)成為檢測(cè)臨床耐藥性的重要手段， 是實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)療的重要一步。

4 cfDNA 在腫瘤中的作用

4.1 介導(dǎo)細(xì)胞間基因轉(zhuǎn)移

1965 年，Bendich 等[55]發(fā)現(xiàn)注入小鼠體內(nèi)的腫瘤DNA 是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的起源，他提出了基因組轉(zhuǎn)移的觀點(diǎn)并得到廣泛驗(yàn)證。 基因組轉(zhuǎn)移假說(shuō)：腫瘤細(xì)胞釋放的cfDNA 可以在距原發(fā)腫瘤一定距離的地方轉(zhuǎn)染健康細(xì)胞，導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移[56]。 Anker 等[57]最先證明了SW480 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基中的cfDNA 對(duì)NIH/3T3 小鼠成纖維細(xì)胞具有轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)化能力。 在加入SW480 培養(yǎng)基后，NIH/3T3 細(xì)胞不僅變得具有腫瘤性， 而且還攜帶SW480 細(xì)胞系中的KRAS突變。2010 年，Garcia 等[58]在攜帶KRAS突變的大腸癌患者中觀察到相同的現(xiàn)象。含有cfDNA 的多種結(jié)構(gòu)都可能與基因組轉(zhuǎn)移有關(guān)，已經(jīng)有研究證明凋亡小體、微粒體、外泌體都可以在腫瘤原發(fā)灶遠(yuǎn)處形成這種變化[19-20]。

4.2 腫瘤細(xì)胞識(shí)別cfDNA 機(jī)制

有研究報(bào)道，cfDNA 是Toll 樣受體（toll-like receptors, TLR） 的分子配體，TLR 存在于樹(shù)突細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中，與先天免疫反應(yīng)有關(guān)。 配體-TLR 相結(jié)合激活轉(zhuǎn)錄因子NFkB/AP1， 該因子可以調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子α （tumor necrosis factor α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（interleukin-1 IL-1）、白細(xì)胞介素-6 （IL-6）， 以及共刺激分子CD80、CD86 表達(dá)。 在特殊的病理狀態(tài)下，cfDNA 可以免于被核酸酶降解，并且可與其他蛋白質(zhì)復(fù)合，移動(dòng)到與核酸識(shí)別相關(guān)的細(xì)胞TLR 中， 如TLR3、TLR7、TLR8、TLR9[59]。 有研究表明，口腔癌細(xì)胞可以表達(dá)TLR3、TLR7、TLR9，相應(yīng)配體刺激其產(chǎn)生，并且可以通過(guò)調(diào)節(jié)趨化因子、炎癥因子、促血管生成因子的表達(dá)，影響腫瘤免疫微環(huán)境，對(duì)腫瘤發(fā)生、發(fā)展起作用[60]。然而HNSCC 產(chǎn)生的cfDNA 將如何影響TLR 表達(dá)，尚無(wú)這方面報(bào)道。

4.3 cfDNA 與腫瘤免疫

cfDNA 是具有免疫刺激特性的生物大分子。 獨(dú)有的雙鏈DNA 分子結(jié)構(gòu)、 特定的序列以及分子間相互作用使其具有刺激免疫反應(yīng)發(fā)生的能力。 暴露于固有免疫系統(tǒng)的cfDNA 可以激活干擾素（interferon，IFN）以及其他促炎因子基因[9]。 有研究發(fā)現(xiàn)，cfDNA 可以通過(guò)細(xì)胞質(zhì)DNA 感應(yīng)機(jī)制[如環(huán)GMPAMP 合 酶（cyclic GMP-AMP synthase，cGAS）]介 導(dǎo)TLR9 獨(dú)立的免疫應(yīng)答， 激活干擾素基因的刺激物（stimulator of interferon gene, STING）導(dǎo)致γ-干擾素（interferon-γ，IFN-γ）分泌增加。另有研究表明IFN-γ可以增強(qiáng)樹(shù)突細(xì)胞對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌的抗腫瘤免疫應(yīng)答[61-62]。Waldvogel 等[63]用健康人血液提取的循環(huán)游離核酸與單核細(xì)胞共培養(yǎng)， 觀察到其固有免疫相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)。 趨化因子可以通過(guò)調(diào)控腫瘤免疫微環(huán)境直接促進(jìn)癌細(xì)胞遷移， 也可以間接促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移擴(kuò)散，促進(jìn)癌癥的發(fā)生、發(fā)展[64]。而HNSCC 產(chǎn)生的cfDNA 如何調(diào)控細(xì)胞因子表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)腫瘤免疫，還有待研究。

綜上所述， 基于cfDNA 的液體活檢是一種無(wú)創(chuàng)、有經(jīng)濟(jì)效益并且具有腫瘤特異性的檢查，多項(xiàng)研究表明cfDNA 可用于HNSCC 診斷、 治療后監(jiān)測(cè)及耐藥性檢測(cè)。 然而，目前cfDNA 檢測(cè)仍然存在敏感度不夠高、缺乏標(biāo)準(zhǔn)化程序等問(wèn)題。 此外，盡管我們已經(jīng)知道產(chǎn)生cfDNA 的機(jī)制可能包括細(xì)胞壞死、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞焦亡、活細(xì)胞釋放，但對(duì)于它的來(lái)源、生物學(xué)特征及生物學(xué)作用，還有待研究。 未來(lái)仍需更多的臨床試驗(yàn)和基礎(chǔ)研究為cfDNA 用于臨床診斷、個(gè)性化精準(zhǔn)治療、藥物開(kāi)發(fā)提供必要的理論基礎(chǔ)。