李 會(huì)，丁瑞霞，靳靜靜，聶俊峰，楊寶平，徐 毅

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 中國(guó)旱區(qū)節(jié)水農(nóng)業(yè)研究院，陜西 楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，農(nóng)業(yè)部西北黃土高原作物生理生態(tài)與耕作重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100； 3.艾力蒙塔貿(mào)易(上海)有限公司，上海 200000)

利用穩(wěn)定同位素自然豐度技術(shù)研究輕元素的同位素組成特征、變化機(jī)理和分餾原理，可以探明這些元素在生態(tài)、環(huán)境體系中轉(zhuǎn)化過(guò)程和循環(huán)規(guī)律[1].元素分析儀-同位素比質(zhì)譜儀(EA-IRMS)聯(lián)用技術(shù)具有樣品前處理簡(jiǎn)單、用量少、儀器操作簡(jiǎn)便、測(cè)量精度高和分析速度快[2-4]等優(yōu)點(diǎn)，在穩(wěn)定同位素分析方面得到了廣泛的應(yīng)用.

本實(shí)驗(yàn)室購(gòu)置的穩(wěn)定同位素比質(zhì)譜儀(Isoprime100, Elementar UK, Co., Ltd)可以和元素分析儀(Vario Pyro Cube Elementar Co., Ltd)相連接，用來(lái)進(jìn)行 C、N、O、H穩(wěn)定同位素比值分析，同時(shí)也可以給出相應(yīng)元素的百分含量結(jié)果.本文總結(jié)了EA-IRMS系統(tǒng)CN分析模式的組成及功能、基本原理、日常維護(hù)注意事項(xiàng)、日常操作步驟等內(nèi)容，以期為EA-IRMS系統(tǒng)的使用提供參考.從而提高儀器的使用效率，更好的為科研工作服務(wù).

1 EA-IRMS系統(tǒng)組成及功能

EA-IRMS系統(tǒng)主要由4部分組成：元素分析儀、稀釋器、參考?xì)膺M(jìn)樣器和Isoprime100質(zhì)譜儀.(1)元素分析儀由120位單層進(jìn)樣盤(pán)、燃燒/還原反應(yīng)爐、熱導(dǎo)池檢測(cè)系統(tǒng)組成，為樣品的前處理裝置，通過(guò)高溫燃燒，將樣品轉(zhuǎn)化為CO2和N2.(2)稀釋器使用純He氣與進(jìn)入到質(zhì)譜儀的元素分析儀載氣混合，達(dá)到降低樣品濃度的作用.對(duì)于高C∶N比樣品，如果CO2濃度過(guò)高，將會(huì)超出質(zhì)譜儀檢測(cè)器測(cè)量量程.(3)參考?xì)膺M(jìn)樣器用于調(diào)諧和測(cè)試IRMS離子源參數(shù)，檢驗(yàn)系統(tǒng)穩(wěn)定性和線(xiàn)性.在測(cè)量樣品時(shí)，用于計(jì)算校正樣品的同位素結(jié)果.參考?xì)饧醇兊腃O2和N2，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為99.995%.(4)Isoprime100質(zhì)譜儀由真空系統(tǒng)、控制系統(tǒng)、離子源、質(zhì)量分析器、法拉第接收杯陣列和計(jì)算機(jī)系統(tǒng)組成.利用離子光學(xué)和電磁場(chǎng)原理，根據(jù)不同質(zhì)荷比(m/e)離子在電磁場(chǎng)中飛行偏轉(zhuǎn)半徑的不同進(jìn)行質(zhì)量數(shù)分離，從而測(cè)定各個(gè)質(zhì)量數(shù)同位素的離子流強(qiáng)度.

2 EA-IRMS系統(tǒng)工作原理簡(jiǎn)述

被測(cè)樣品在錫舟的緊密包裹下通過(guò)自動(dòng)進(jìn)樣器送入EA燃燒管(950 ℃)內(nèi)，樣品在填有CuO催化劑的燃燒管內(nèi)富氧條件下充分燃燒，碳和氮組分分別生成CO2和氮氧化物.燃燒產(chǎn)物隨流速恒定的載氣 He氣載入還原反應(yīng)管，還原管中的線(xiàn)狀銅將氮氧化物(NO、N2O、N2O2)還原成N2，并將多余的氧氣吸收，揮發(fā)性的鹵素化合物則被位于還原管上方的銀絲層吸收[2-3].經(jīng)過(guò)裝有P2O5的干燥管將樣品燃燒產(chǎn)生的H2O去除.混合樣品氣進(jìn)入到CO2吸附柱.CO2吸附柱在室溫下可完全將樣品產(chǎn)生的CO2保留其中，而對(duì)N2無(wú)保留.待N2測(cè)量結(jié)束后系統(tǒng)自動(dòng)加熱CO2吸附柱至110 ℃，可將CO2脫附出來(lái).N2和CO2從元素分析儀尾部由氦氣引入IRMS的離子源中.離子源將N2或CO2樣品中的原子、分子電離成為離子，質(zhì)量分析器將離子按照質(zhì)荷比的大小分離開(kāi)，以離子檢測(cè)器測(cè)量記錄離子流強(qiáng)度，用高純N2(99.995%)和高純CO2(99.995%)作為參考標(biāo)準(zhǔn)，得出質(zhì)譜圖.最后通過(guò)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行計(jì)算，最終測(cè)得樣品δ13C和δ15N值.

3 CN模式日常維護(hù)

在進(jìn)行樣品分析前，需要對(duì)EA-IRMS系統(tǒng)進(jìn)行常規(guī)維護(hù)，確保系統(tǒng)的穩(wěn)定性，保證測(cè)樣的準(zhǔn)確性.

3.1 EA部分

3.1.1 清理灰分管

通常每測(cè)試200個(gè)左右植物樣或60個(gè)左右土壤樣品需要清理一次灰分管.若灰分累積過(guò)高會(huì)堵塞加氧槍出口，導(dǎo)致無(wú)法通氧燃燒.

3.1.2 還原銅消耗情況

在升溫前檢查還原銅消耗情況，確保在樣品連續(xù)分析過(guò)程中還原效率.如果還原銅消耗過(guò)度，則會(huì)出現(xiàn)：(1)產(chǎn)生的氮氧化物不能完全被還原為N2，仍存在少量氮氧化物分子.(2)無(wú)法完全吸收燃燒時(shí)多余的氧氣，導(dǎo)致氧氣和氮?dú)馔瑫r(shí)進(jìn)入到離子源內(nèi)，形成NO+離子碎片，從而導(dǎo)致測(cè)試結(jié)果不準(zhǔn)確.若還原銅完全消耗，EA軟件監(jiān)測(cè)程序自動(dòng)終止儀器運(yùn)行.

3.1.3 干燥劑P2O5變色情況

檢查干燥劑P2O5變色情況，及時(shí)更換.干燥管中P2O5出現(xiàn)2/3變色時(shí)，需及時(shí)更換.如果氣體中存在大量水，會(huì)影響CO2分析結(jié)果.

3.2 質(zhì)譜儀部分

3.2.1 系統(tǒng)真空度值偏高或偏低

當(dāng)High Vac 小于2×10-11MPa，Low Vac小于3×10-6MPa時(shí)，說(shuō)明儀器達(dá)到理想水平.系統(tǒng)真空值受質(zhì)譜儀連接的毛細(xì)管長(zhǎng)短的影響.如果真空值異常，需從以下方面進(jìn)行解決：(1)毛細(xì)管或其他部分堵塞.(2)質(zhì)譜儀中進(jìn)空氣.(3)載氣不純.(4)毛細(xì)管折斷，導(dǎo)致氣路漏氣等.

3.2.2 峰型異常

峰中心掃描是指離子流進(jìn)入到法拉第接收杯中心位置時(shí)對(duì)應(yīng)的加速電壓值，通常會(huì)得到一個(gè)對(duì)稱(chēng)的、頂部平坦的峰.當(dāng)質(zhì)譜儀受環(huán)境溫度影響，磁場(chǎng)或離子源溫度輕微變化也不會(huì)對(duì)測(cè)量信號(hào)的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響.如果峰型異常，需從以下方面進(jìn)行解決：(1)調(diào)諧離子源參數(shù).(2)檢查電磁鐵物理位置.(3)更換燈絲.(4)清洗離子源.

3.2.3 本底信號(hào)值異常

正常的本底信號(hào)值為：N2Mass 28<3×10-11A，Mass 29<3×10-13A.CO2Mass 44<2×10-11A，Mass 45<2×10-13A，Mass 46<2×10-13A.如果儀器首次開(kāi)啟，氣路內(nèi)會(huì)吸附或殘留一些雜質(zhì)氣體，建議將氦氣打開(kāi)吹掃12 h后再進(jìn)行測(cè)試.

3.2.4 檢漏背景掃描信號(hào)值高

N2氣Mass 28信號(hào)值很高或Mass 28/32(N2/O2)信號(hào)強(qiáng)度比值接近3∶1或4∶1，說(shuō)明系統(tǒng)有漏氣的地方，需進(jìn)行分步檢漏進(jìn)行排查.

3.2.5 參考?xì)夥€(wěn)定性和線(xiàn)性測(cè)試

樣品分析開(kāi)始前，需要利用參考?xì)膺M(jìn)行系統(tǒng)穩(wěn)定性測(cè)試和線(xiàn)性測(cè)試.穩(wěn)定性分析結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)偏差要求如下：CO2≤0.06‰，N2≤0.06‰.如果結(jié)果不符合要求，需要檢查判斷：(1)本底信號(hào)是否太高.(2)離子源參數(shù)是否正常.(3)峰中心是否正確.(4)氦氣質(zhì)量是否達(dá)到要求.(5)參考?xì)忉橀y是否工作正常.(6)元素分析儀是否有干擾.線(xiàn)性分析結(jié)果要求斜率：CO2≤0.02‰/nA，N2≤0.02‰/nA.如果結(jié)果不符合要求，需要檢查判斷：(1)穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果是否符合要求.(2)離子源參數(shù)是否需要調(diào)諧.

3.3 外設(shè)部分

(1)機(jī)械泵泵油顏色：正常為無(wú)色透明，如果發(fā)黃或渾濁則需要換掉.(2)機(jī)械泵泵油油位線(xiàn)：泵油的液面在最高線(xiàn)和最低線(xiàn)之間.(3)鋼瓶的壓力：總壓力表壓力低于1 Mpa時(shí)，需要更換鋼瓶.

4 儀器操作步驟

4.1 EA-IRMS系統(tǒng)開(kāi)機(jī)

4.1.1 質(zhì)譜儀開(kāi)機(jī)

(1)接通Isoprime100質(zhì)譜儀主機(jī)電源.(2)打開(kāi)電腦主機(jī)，運(yùn)行IonVantage 質(zhì)譜控制軟件.(3)確認(rèn)質(zhì)譜儀上黃色隔離閥處于關(guān)閉狀態(tài).(4)開(kāi)空氣壓縮機(jī).(5)開(kāi)機(jī)械泵.(6)啟動(dòng)渦輪分子泵.

4.1.2 EA開(kāi)機(jī)

(1)打開(kāi)測(cè)試所需He、N2、CO2、O2鋼瓶總閥，O2分壓表壓力調(diào)至0.2 MPa，其他氣體鋼瓶分壓表壓力調(diào)至0.4 MPa.確認(rèn)參考?xì)膺M(jìn)樣器上He壓力顯示正常，打開(kāi)稀釋器后面的綠色閥門(mén).(2)打開(kāi)EA電源，待完成自檢后運(yùn)行EA軟件.(3)EA內(nèi)部氣路檢漏.系統(tǒng)升溫前，需要對(duì)EA內(nèi)部氣路進(jìn)行檢漏，通過(guò)后再升溫.如果EA內(nèi)部氣路漏氣將導(dǎo)致系統(tǒng)不穩(wěn)定.(4)反應(yīng)管升溫.升溫前確保氦氣有流速.燃燒管920 ℃，還原管600 ℃.

4.1.3 EA和質(zhì)譜儀聯(lián)機(jī)

(1)確認(rèn)離子源處于關(guān)閉狀態(tài).(2)打開(kāi)質(zhì)譜儀主機(jī)上黃色隔離閥.(3)打開(kāi)離子源.

4.2 系統(tǒng)測(cè)試

4.2.1 EA空白樣品測(cè)試

EA軟件中，Name、Weight、Method為必填參數(shù)，測(cè)試結(jié)果：N Area ≤100，C Area≤100，說(shuō)明EA穩(wěn)定性好.系統(tǒng)本底空白過(guò)高會(huì)影響結(jié)果.

4.2.2 離子源調(diào)諧控制測(cè)試

隨著時(shí)間和環(huán)境的改變，每個(gè)質(zhì)量數(shù)對(duì)應(yīng)的磁場(chǎng)或加速電壓可能會(huì)發(fā)生微小的偏移.因此在測(cè)試樣品前必須進(jìn)行離子源調(diào)諧，以保證質(zhì)譜儀離子束處于最優(yōu)化的狀態(tài).經(jīng)離子源調(diào)諧，優(yōu)化加速電壓，優(yōu)化后的加速電壓分別為：N24 153.92 V；CO23 930.90 V.

離子源調(diào)諧控制測(cè)試方法，以N2參考?xì)鉃槔?1)在 Iso Prime Tune Page 窗口→File→Load Tuning→調(diào)出CF- N2.itf- Iso Prime Tune Page窗口.(2)打開(kāi)N2參考?xì)膺M(jìn)樣閥，在Inlet Method 窗口雙擊RN圖標(biāo).(3)從工具欄中選擇 Acquire → Run Peak Centre，運(yùn)行峰中心掃描.(4)掃描結(jié)束后，Peak Centre Results窗口自動(dòng)彈出.點(diǎn)擊 Accept Peak Centre按鍵，確認(rèn)掃描完成.(5)雙擊RN，關(guān)閉N2參考?xì)?

4.2.3 參考?xì)夥€(wěn)定性測(cè)試

峰面積不穩(wěn)定會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生很大影響，因此在進(jìn)行樣品測(cè)試前，要保證空白樣品產(chǎn)生的峰面積已經(jīng)穩(wěn)定，故要對(duì)N2和CO2標(biāo)準(zhǔn)氣進(jìn)行空白測(cè)定.

穩(wěn)定性測(cè)試方法，以N2參考?xì)鉃槔?1)在質(zhì)譜儀軟件Ionvantage主窗口中點(diǎn)擊File，調(diào)出所需要的Open快捷圖標(biāo)，從彈出窗口中調(diào)用N2參考?xì)獾腟ample list，選擇N2Ref gas tests .(2)選擇需要測(cè)試樣品行，點(diǎn)擊Run快捷圖標(biāo)，勾選Aquire Sample Data和Auto process sample，點(diǎn)擊確定.等待30 s左右，系統(tǒng)開(kāi)始測(cè)試.

測(cè)試完成后，檢查參考?xì)夥€(wěn)定性結(jié)果是否符合要求.

4.2.4 參考?xì)饩€(xiàn)性測(cè)試

在參考?xì)夥€(wěn)定性測(cè)試符合要求后，再進(jìn)行線(xiàn)性測(cè)試.在質(zhì)譜儀正常的動(dòng)態(tài)檢查范圍內(nèi)，測(cè)量的同位素比值不會(huì)隨信號(hào)強(qiáng)弱的不同而改變，這樣才能確保對(duì)不同樣品進(jìn)行分析時(shí),可以獲得可信的同位素結(jié)果.

線(xiàn)性測(cè)試方法，以N2參考?xì)鉃槔?測(cè)試方法和上述參考?xì)夥€(wěn)定性測(cè)試相同，只是在進(jìn)樣過(guò)程中改變參考?xì)膺M(jìn)樣器上相對(duì)應(yīng)的參考?xì)鈮毫Γ瑥? nA逐步調(diào)至10 nA，一般調(diào)9次壓力，使每個(gè)參考?xì)夥宥季哂胁煌男盘?hào)高度.

(1)雙擊打開(kāi)RN.(2)將信號(hào)調(diào)至1 nA，等待RN自動(dòng)關(guān)閉.(3)RN再自動(dòng)打開(kāi).(4)RN再自動(dòng)關(guān)閉.(5)第一次調(diào)信號(hào).

CO2調(diào)節(jié)方式與N2相同.在完成參考?xì)饩€(xiàn)性測(cè)試后，根據(jù)樣品出峰順序，將離子源參數(shù)調(diào)回到第一個(gè)出峰元素所對(duì)應(yīng)的參數(shù)下面.如CN模式分析，將離子源參數(shù)選擇為N2.當(dāng)上述各項(xiàng)狀態(tài)指標(biāo)都確認(rèn)在正常范圍，表明系統(tǒng)達(dá)到了理想穩(wěn)定的樣品分析狀態(tài)，可以根據(jù)需要進(jìn)行樣品分析.

4.2.5 標(biāo)準(zhǔn)樣品測(cè)試

(1)使用實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，如乙酰苯胺、甘氨酸等，重復(fù)測(cè)試3～5次.檢查結(jié)果外精度是否符合要求：δ15N ≤0.15 ‰，δ13C ≤0.10 ‰.

(2)使用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，進(jìn)行單點(diǎn)或多點(diǎn)校正.如果樣品測(cè)定的同位素值范圍變化不大，可以使用單點(diǎn)校正法.如果樣品測(cè)定的同位素值范圍變化較大，建議使用多點(diǎn)校正法.

單點(diǎn)較正法具體步驟，以硫酸銨標(biāo)樣為例：首先至少重復(fù)測(cè)量3～5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品，δ15N值精度(標(biāo)準(zhǔn)偏差)小于 0.15‰，即表明系統(tǒng)分析結(jié)果穩(wěn)定.硫酸銨標(biāo)樣δ15N 值Tstd為20.3‰，分析結(jié)果的平均值Mstd 為21.8‰，首先計(jì)算這個(gè)差值diff=Mstd-Tstd=21.8‰-(20.3‰)=1.5‰.在 Inlet Method 窗口下，選擇 Data Processing→Edit Species，在彈出窗口中選擇N2參考?xì)怏w，選擇 Edit.進(jìn)入后點(diǎn)擊 Reference gas 后面的Edit 鍵.在Calibration Delta Values中，重新計(jì)算 Ratio1 的值.目前顯示值為0.3‰，則其真實(shí)的 δ15N值=0.3‰-1.5‰=-1.2‰.在上欄中，將計(jì)算好的 δ 值重新輸入，保存后即可.在以后的樣品計(jì)算時(shí)就會(huì)按照這個(gè)新的 δ 值進(jìn)行計(jì)算.

多點(diǎn)校正法具體步驟 ：選擇多種不同豐度的同位素標(biāo)準(zhǔn)樣品，一般3個(gè)以上.每個(gè)標(biāo)樣重復(fù)測(cè)量5次，確保標(biāo)準(zhǔn)偏差小于0.15‰.使用測(cè)量值的平均值與標(biāo)準(zhǔn)值擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，建立測(cè)量值與標(biāo)準(zhǔn)值之間的回歸關(guān)系，一般要求R2大于0.999 9.利用該曲線(xiàn)將樣品的測(cè)量值進(jìn)行回歸處理，最終得到樣品的標(biāo)定值.

(3)測(cè)試樣品，每分析10～15個(gè)樣品后測(cè)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，用于檢測(cè)數(shù)據(jù)分析穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性.

4.3 EA-IRMS系統(tǒng)待機(jī)、關(guān)機(jī)及從待機(jī)狀態(tài)恢復(fù)到測(cè)樣狀態(tài)

4.3.1 質(zhì)譜儀日常待機(jī)

質(zhì)譜儀需在高真空狀態(tài)下運(yùn)行，頻繁開(kāi)關(guān)機(jī)不僅對(duì)分子泵的壽命有影響，也會(huì)降低日常工作效率.如果測(cè)樣間隔2周以?xún)?nèi)，可使質(zhì)譜儀進(jìn)入待機(jī)狀態(tài)：(1)EA降溫至100 ℃以下后，關(guān)EA軟件，關(guān)EA主機(jī).(2)關(guān)閉離子源.(3)關(guān)閉質(zhì)譜儀上黃色隔離閥.

4.3.2 儀器從待機(jī)狀態(tài)恢復(fù)到測(cè)樣狀態(tài)

(1)按步驟EA開(kāi)機(jī).(2)確認(rèn)離子源處于關(guān)閉狀態(tài).(3)打開(kāi)質(zhì)譜儀黃色隔離閥.(4)打開(kāi)離子源.

4.3.3 質(zhì)譜儀關(guān)機(jī)

如果間隔2周以上不測(cè)試樣品，質(zhì)譜儀需關(guān)機(jī)：(1)確認(rèn)質(zhì)譜儀黃色隔離閥處于關(guān)閉狀態(tài).(2)關(guān)閉離子源.(3)停止分子泵.待IP Turbo Speed 轉(zhuǎn)速下降至10%以后，關(guān)閉質(zhì)譜儀背后圓形黑色隔離閥.(4)關(guān)閉機(jī)械泵.(5)關(guān)閉Ionvantage軟件，關(guān)閉計(jì)算機(jī).(6)關(guān)閉實(shí)驗(yàn)室電源.

5 結(jié)語(yǔ)

EA-IRMS系統(tǒng)在國(guó)內(nèi)外已廣泛應(yīng)用于植物生理生態(tài)學(xué)、農(nóng)田土壤結(jié)構(gòu)、生物地球化學(xué)、氣候變化、物質(zhì)溯源以及摻假辨識(shí)、原油氮沉積環(huán)境、城市湖泊沉積物、農(nóng)業(yè)面源污染[5-19]等領(lǐng)域中碳氮同位素組成的測(cè)定.正確的操作步驟和日常的維護(hù)保養(yǎng)對(duì)保證儀器分析數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和精密度等具有重要意義.因此，建議規(guī)范化操作，專(zhuān)人管理，定期維護(hù).