任 猛 左秋杰

（長虹美菱股份有限公司 合肥 230001）

引言

前期研究發(fā)現(xiàn)，電場條件下保鮮效果存在明顯差異，具體表現(xiàn)在：①不同電場條件下保鮮效果的差異；②不同代謝類型果蔬電場作用效果的差異，主要表現(xiàn)在呼吸躍變型和非呼吸躍變型水果。而根據(jù)文獻以及資料搜集，并無相關(guān)的研究分析。

果蔬作為活體，需要進行一系列的代謝維持機體正常的生活活動，包括營養(yǎng)物質(zhì)合成代謝和消耗代謝，而這些代謝活動強弱均由相關(guān)的酶所催化。根據(jù)生物學(xué)遺傳知識，酶由基因編碼控制，因此果蔬代謝的相關(guān)變化其實就是代謝途徑中相關(guān)酶活性及其含量發(fā)生變化的結(jié)果，所有的生命活動均由基因所控制[1]。從基因?qū)用娼馕鲭妶鎏幚淼谋ｕr機理，根據(jù)電場處理對水果基因表達的影響進行研究，找到電場處理對于熱帶水果代謝影響等更深層次的機理，能夠更好解釋電場對于熱帶水果作用的機理。本文通過實驗分析不同電場強度下對于呼吸躍變型果蔬乙烯的釋放以及呼吸強度的影響，確定電場適宜的催熟處理條件。實現(xiàn)電場技術(shù)優(yōu)化的同時，解決熱帶水果存儲難的問題，為熱帶水果在冰箱中的保鮮提供技術(shù)以及理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料選擇及依據(jù)

選擇香蕉作為電場處理的研究材料，電場為高壓靜電場，電場強度為30～200 V內(nèi)。由于香蕉作為熱帶水果，具有可靠的基因組信息資源可供利用，便于后續(xù)的基因信息挖掘。電場強度選擇根據(jù)前期保鮮效果試驗結(jié)果確定。

1.2 試驗設(shè)備

美菱BCD-481WQ3M冰箱2臺，高壓靜電場模塊、氣相色譜儀等。

1.3 分析方法

測定電場條件下香蕉代謝基因表達差異性，結(jié)合主要代謝指標(biāo)（酶活、丙二醛、乙烯）數(shù)據(jù)，分析電場熱帶水果保鮮的機理。

2 試驗方法

2.1 基因分析方法

選擇香蕉作為試驗材料，通過電場處理，進行轉(zhuǎn)錄組分析。測試樣品分別存儲在適宜溫度（12 ℃）條件下設(shè)有電場模塊的冰箱以及對照冰箱。每兩天測試乙烯釋放量，在最佳效果的時間點取樣（根據(jù)對照與試驗組數(shù)據(jù)出現(xiàn)明顯差異判斷），提取樣品總RNA進行轉(zhuǎn)錄組測序和分析，統(tǒng)計差異基因，結(jié)合代謝通路進行分析。

2.2 酶活性測試

2.2.1 酶液的提取

稱取樣品10 g預(yù)冷研磨，加入20 mL 經(jīng)預(yù)冷處理的95 %乙醇，低溫靜置10 min后，低溫4 ℃下12 000 r/min離心20 min，去除上清液。重復(fù)上述操作后，加入5 mL預(yù)冷的1.8 mol/L NaCl提取緩沖溶液（50 mmol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液，pH值為5.5），4 ℃條件下放置20 min，離心后收集上清液，于 4 ℃ 保存。

2.2.2 多聚半乳糖醛酸酶[2]活性測定

取2支試管，均加入1 mL 50 mmol/L，pH 5.5乙酸-乙酸鈉緩沖溶液和0.5 mL 10g/L多聚半乳糖醛酸溶液（1.0 g多聚半乳糖醛酸溶于100 mL 50 mmol/L pH 5.5乙酸-乙酸鈉緩沖溶液），1支試管加入0.5 mL酶提取液，另1支加入0.5 mL經(jīng)煮沸5 min的酶提取液作為對照并標(biāo)記，混勻后在37 ℃保溫1 h，保溫后迅速加入1.5 mL 3，5-二硝基水楊酸 （DNS），沸水浴 5 min，取出后經(jīng)流水冷卻，蒸餾水稀釋至25 mL，在540 nm處測定吸光度。計算酶活，公式如下：

式中：

M′—從標(biāo)準曲線查的葡萄糖質(zhì)量，mg；

V—樣品提取液總體積，mL；

VS—測定時索取樣品提取液體積，mL；

T—酶促反應(yīng)時間，h；

M—樣品質(zhì)量，g。

2.2.3 羧甲基纖維素酶活性測定

取2支試管，每支加入1.5 mL底物（底物配制:稱取1.0 g羧甲基纖維素鈉溶于 pH值為5.0的 50 mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中，定容到100 mL），1支試管加入0.5 mL酶提取液，另1支加入0.5 mL經(jīng)煮沸5 min的酶提取液作為對照，混勻后在37 ℃保溫1 h，保溫后迅速加入1.5 mL 3，5-二硝基水楊酸（DNS），沸水浴 5 min，取出后經(jīng)流水冷卻，蒸餾水稀釋至25 mL，在540 nm處測定吸光度。

計算公式：

式中：

m′—從標(biāo)準曲線查的葡萄糖質(zhì)量，mg；

V—樣品提取液總體積，mL；

VS—測定時索取樣品提取液體積，mL；

T—酶促反應(yīng)時間，h；

M—樣品質(zhì)量，g。

3 結(jié)果與分析

3.1 測序樣品乙烯釋放量的測定

從表1中可以看出，香蕉從第4 天開始乙烯釋放量開始出現(xiàn)差異，第6天的差異比較顯著，顯示了通過抑制乙烯達到保鮮的效果，由此選擇最佳電場強度處理6 d的香蕉作為測序的樣品。

3.2 香蕉Unigene功能注釋及相關(guān)性分析

根據(jù)測試分析，71 139個unigenes被成功注釋。Unigenes有48.72 %與Nr數(shù)據(jù)庫一致，有30.76 %的unigenes得到GO注解，分別有20.77 %，11.88 %和31.91 %的 unigenes得到KEGG，COG，Pfam數(shù)據(jù)庫的注釋。香蕉unigenes功能注釋圖見圖1。

通過樣品之間相關(guān)性的分析（如圖2），可觀察組內(nèi)樣品之間的生物學(xué)重復(fù)性。同時組內(nèi)樣品相對組間樣品的相關(guān)系數(shù)越高，獲得的差異代謝物越可靠，且驗證了試驗設(shè)計的合理性。如圖3～5所示，可以看到相關(guān)系數(shù)均在0.92以上，說明測定的樣本穩(wěn)定性較好，獲得的數(shù)據(jù)質(zhì)量高，可以進行下一步的轉(zhuǎn)錄組測序分析。

表1 香蕉在不同電場強度的乙烯釋放量

圖1 香蕉unigenes功能注釋圖

圖2 香蕉相關(guān)性分析

圖3 香蕉差異基因統(tǒng)計圖

圖4 差異基因富集分析

3.3 差異基因的篩選

電場處理果實中有150個基因的表達水平受到顯著影響，進一步研究發(fā)現(xiàn)這150個基因中有127個基因的表達量增加了，而剩下的23個基因表達量下降了，如圖3～5所示；進一步分析發(fā)現(xiàn)，這有150受到電場處理影響的基因里面有3個與乙烯有關(guān)，7個與細胞壁代謝有關(guān)以及32個與細胞膜結(jié)構(gòu)和代謝有關(guān)（見表2），這些基因的表達變化會影響到電場處理后的果實乙烯生成情況，果實軟化和細胞膜的透性或者衰老特性。除此之外，其他受到電場處理的差異表達基因大多是和蛋白質(zhì)的折疊和加工相關(guān)，這些蛋白與果實的保鮮關(guān)系不大。

表2 與乙烯，細胞壁以及細胞膜相關(guān)的差異基因統(tǒng)計表

圖5 植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)代謝通路圖

考慮到上述差異基因大部分集中于生物體的蛋白質(zhì)加工和代謝過程，這些與保鮮關(guān)系不大。參考差異基因以及代謝通路，結(jié)合乙烯釋放量的差異，電場處理導(dǎo)致了香蕉中的乙烯信號傳導(dǎo)途徑關(guān)鍵酶編碼基因EIN3受到影響，抑制乙烯的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，阻斷乙烯在細胞間的傳遞，使乙烯不能和乙烯受體結(jié)合，也就是細胞不能感受到乙烯信號，最終延緩水果的成熟衰老過程；另外，在植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)現(xiàn)，細胞在油菜素類固醇正常生成后，油菜素類固醇作為一種信號調(diào)控關(guān)鍵酶基因TCH4（木葡聚糖:木葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶）被電場處理后顯著上調(diào)表達，也就意味著木葡聚糖：木葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的活性得到增強，促進細胞壁半纖維素類多糖—木葡聚糖的生成，促進細胞壁的生成和活性，從而控制細胞增大，保持細胞硬度，維持水果新鮮度。電場施加之后，作為一種信號進入植物MAPK信號通路中，調(diào)控信號通路中的關(guān)鍵酶的基因RBOH（呼吸爆發(fā)氧化酶）上調(diào)表達，RBOH作為一種呼吸作用氧化酶，以氧氣和過氧化氫為受體，可以消耗細胞內(nèi)的氧化物質(zhì)，維持細胞內(nèi)的活性氧的穩(wěn)態(tài)，防止細胞氧化包括細胞膜的過氧化，維持細胞內(nèi)正常氧化還原狀態(tài)，避免細胞膜的破壞，維持細胞活性，延緩了植物衰老，維持良好品質(zhì)。

3.4 生理指標(biāo)的測試

上述試驗從基因水平解析了電場處理對果實保鮮相關(guān)代謝途徑中關(guān)鍵基因的影響，包括乙烯生物合成和信號傳導(dǎo)，細胞壁的代謝等。生理指標(biāo)測試從細胞和蛋白水平了解電場處理對細胞壁代謝和細胞衰老的影響。其中細胞壁代謝影響果實的軟化，細胞電導(dǎo)率和氧化能力反應(yīng)細胞的衰老水平，也間接反應(yīng)果實的保鮮效果。其中細胞壁代謝相關(guān)酶選擇了多聚半乳糖醛酸酶和纖維素酶；細胞衰老相關(guān)指標(biāo)選擇丙二醛含量指標(biāo)測定。

由表3可以看出，香蕉在電場中其多聚半乳糖醛酸酶，纖維素酶活性均低于對照組香蕉相應(yīng)酶的活性，說明30～200 V電場可以有效抑制這兩種細胞壁酶的活性，抑制了細胞壁的降解，延緩果實軟化；香蕉在電場強度中丙二醛含量和電導(dǎo)率也低于對照組，說明電場可以有效抑制細胞膜過氧化，降低膜的通透性，保持細胞活性，延緩衰老過程，保持水果新鮮度，與轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)分析相吻合，香蕉生理指標(biāo)測定結(jié)果均說明電場對水果的細胞壁和細胞膜不產(chǎn)生傷害，維持細胞壁和細胞膜的完整性和功能，延緩果實軟化和衰老過程，保持果實新鮮。

表3 香蕉電場處理第6天生理指標(biāo)測定表

4 結(jié)論

綜合得知，電場保鮮對于水果的保鮮機理是通過抑制乙烯信號傳導(dǎo)過程關(guān)鍵基因，抑制乙烯在細胞內(nèi)的傳遞，使乙烯不能與受體結(jié)合，實現(xiàn)果蔬催熟過程抑制的同時，調(diào)控細胞壁多糖代謝過程，調(diào)控與細胞壁相關(guān)酶基因，實現(xiàn)酶活性的調(diào)節(jié)，具體表現(xiàn)在促進細胞壁的生成，維持細胞活性。