王邦，谷峰

CRISPR-Cas9對人類線粒體基因組微同源區(qū)切割后產(chǎn)生新生變異

王邦，谷峰

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬眼視光醫(yī)院，眼視光學(xué)和視覺科學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，溫州 325027

線粒體是真核細(xì)胞的一種細(xì)胞器，其含有線粒體基因組(mtDNA,mitochondrial DNA)，是細(xì)胞能量制造、多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及重要代謝物合成的中心。人類mtDNA長約16.6 kb，編碼13個呼吸鏈所必需的蛋白以及24個蛋白翻譯必需的RNA。人類mtDNA的突變會導(dǎo)致很多種重大疾病，比如神經(jīng)退行性疾病、糖尿病、癌癥、心血管疾病等[1]。因此，線粒體相關(guān)疾病是人類重大疾病的重要組成部分。細(xì)胞由于有氧呼吸作用產(chǎn)生的氧自由基簇(reactive oxygen species, ROS)，無時無刻不在損傷mtDNA，進(jìn)而誘發(fā)mtDNA突變。目前利用靶向突變mtDNA的核酸酶(如mito-ZFNs/TALENs, mitochondria-targeted zinc fingernucleases/transcription activator-like effector nucleases)可以有效去除帶有突變的線粒體。這在線粒體疾病臨床治療方面具有重要應(yīng)用前景[2~4]。這個過程具體包括：利用mito-ZFNs/TALENs切割突變的mtDNA，從而產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂，由此導(dǎo)致突變的mtDNA降解，這樣達(dá)到去除致病mtDNA的目的。例如，Carlos T. Moraes團(tuán)隊(duì)利用AAV9進(jìn)行在體遞送mito-TALENs到線粒體，其可特異性切割含有突變m.5024C>T (tRNA基因)的小鼠mtDNA，實(shí)現(xiàn)了在肌肉和心臟細(xì)胞線粒體中tRNA表達(dá)量的恢復(fù)[3]，有望能治療該突變導(dǎo)致的心臟疾病。與此類似，另一個相似工作，同樣是修復(fù)能導(dǎo)致心臟疾病的突變m.5024C>T，只是使用了mito-ZFNs[4]。說明多種核酸酶均可以在哺乳動物線粒體中發(fā)揮活性切割。而在水稻和油菜中，利用特異性切割mtDNA上胞質(zhì)雄性不育相關(guān)基因和，實(shí)現(xiàn)了以同源重組方式對mtDNA進(jìn)行編輯，恢復(fù)了雄性可育性[5]。同樣在TALE (transcription activator-like effector)基礎(chǔ)上，融合來自于新洋蔥伯克霍爾德菌()的毒素蛋白——胞嘧啶核苷脫氨酶DddA (double-stranded DNA deaminase toxin A)，使DddA能在TALE的引導(dǎo)下靶向人類mtDNA，催化胞嘧啶堿基(C)轉(zhuǎn)換為尿嘧啶(U)，并在其后mtDNA復(fù)制中轉(zhuǎn)為胸腺嘧啶(T)，從而實(shí)現(xiàn)mtDNA的定點(diǎn)堿基轉(zhuǎn)換[6]。

然而曝露在ROS的人類mtDNA不僅有堿基官能團(tuán)的損傷，還有雙鏈斷裂的損傷。在產(chǎn)生雙鏈斷裂后，除了目前被領(lǐng)域廣泛認(rèn)可的mtDNA丟失以外，切割后的mtDNA是否能夠以某種方式留在細(xì)胞中，目前仍然不清楚。該問題是線粒體生物學(xué)中一個非常重要的基礎(chǔ)科學(xué)問題，因?yàn)樵搯栴}關(guān)系到線粒體基因組到底有沒有DNA修復(fù)。如果有，是如何修復(fù)的？同時，該問題的回答也具有重要臨床意義，因?yàn)槠潢P(guān)系到以基因組編輯為基礎(chǔ)的線粒體臨床治療可能存在潛在的副作用。

針對上述問題，本團(tuán)隊(duì)利用線粒體靶向的信號肽融合了來自金黃色葡球菌()的Cas9 (mito-SaCas9)[7]，測試了多個mtDNA位點(diǎn)，令人驚訝地發(fā)現(xiàn)有些位點(diǎn)會產(chǎn)生小片段缺失或插入(圖1)。進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)這些序列具有一定的序列特異性，即具有微同源序列(5~25 bp)的區(qū)域在經(jīng)過切割后可以形成突變。隨后通過限制性內(nèi)切酶將突變的序列進(jìn)行富集，利用一代測序能夠檢測到缺失或插入突變。且由此導(dǎo)致的mtDNA突變隨著細(xì)胞分裂，可以穩(wěn)定地遺傳給子代細(xì)胞。但是，利用只能對DNA雙鏈中產(chǎn)生缺口的缺口酶Cas9 (Cas9 nickase)進(jìn)行作用，結(jié)果顯示不能使mtDNA產(chǎn)生突變，這些結(jié)果提示突變是由于線粒體中雙鏈斷裂修復(fù)途徑誘發(fā)所導(dǎo)致(圖1)。

如何進(jìn)一步提高突變的發(fā)生率呢？通過聯(lián)合多重單向?qū)NA (single guide RNA, sgRNA)以及使用雙鏈斷裂修復(fù)的小分子抑制劑，可以顯著提高突變的發(fā)生率(0.01%~0.03%)，顯示mtDNA雙鏈斷裂修復(fù)過程中，突變發(fā)生的可塑性。此項(xiàng)工作為線粒體基因組DNA修復(fù)機(jī)制提供了新的認(rèn)識，并對目前利用基因編輯技術(shù)治療線粒體遺傳病具有重要參考價值。需要指出的是，本研究中mtDNA突變的效率遠(yuǎn)低于前文所提及的DddA介導(dǎo)的單堿基編輯效率[6]，表明在線粒體中mtDNA雙鏈斷裂誘導(dǎo)的修復(fù)活性不如堿基切除修復(fù)。未來開發(fā)高效、簡便的mtDNA編輯工具仍然是線粒體基因編輯的重要研究內(nèi)容。該工作于2020年11月26日提前在線發(fā)表在(http://engine.scichina.com/doi/ 10.1007/s11427-020-1819-8)。溫州醫(yī)科大學(xué)王邦博士為該論文第一作者，谷峰研究員為論文通訊作者。該研究得到了國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃和浙江省自然科學(xué)基金資助。

圖1 線粒體基因組微同源區(qū)域雙鏈斷裂誘發(fā)的新生突變

線粒體基因組微同源區(qū)域(由5~25 bp直接重復(fù)序列構(gòu)成，圖中紅色標(biāo)記片段)在mito-CRISPR/Cas9切割產(chǎn)生雙鏈斷裂后，大部分會走入線粒體降解途徑；少量在線粒體基因組雙鏈斷裂修復(fù)機(jī)制的作用下，被修復(fù)，同時可能產(chǎn)生缺失或插入的新生突變。

[1] Russell OM, Gorman GS, Lightowlers RN, Turnbull DM. Mitochondrial diseases: Hope for the future, 2020, 181(1): 168–188.

[2] Reddy P, Ocampo A, Suzuki K, Luo JP, Bacman SR, Williams SL, Sugawara A, Okamura D, Tsunekawa Y, Wu J, Lam D, Xiong X, Montserrat N, Esteban CR, Liu GH, Sancho-Martinez I, Manau D, Civico S, CardellachF, Del Mar O'Callaghan M. Campistol J, Zhao HM, Cam-pistol J, Moraes CT, Belmonte JCI. Selective elimination of mitochondrial mutations in the germline by genome editing, 2015, 161(3): 459–469.

[3] Bacman SR, Kauppila JHK, Pereira CV, Nissanka N, Miranda M, Pinto M, Williams SL, Larsson NG, Stewart JB, Moraes CT. MitoTALEN reduces mutant mtDNA load and restores tRNAAlalevels in a mouse model of heteroplasmic mtDNA mutation, 2018, 24(11): 1696–1700.

[4] Gammage PA, Viscomi C, Simard ML, Costa ASH, Gaude E, Powell CA, Van Haute L, McCann BJ, Rebelo-Guiomar P, Cerutti R, Zhang L, Rebar EJ, Zeviani M, Frezza C, Stewart JB, Minczuk M. Genome editing in mitochondria corrects a pathogenic mtDNA mutation, 2018, 24(11): 1691–1695.

[5] Kazama T, Okuno M, Watari Y, Yanase S, Koizuka C, Tsuruta Y, Sugaya H, Toyoda A, Itoh T, Tsutsumi N, Toriyama K, Koizuka N, Arimura SI. Curing cytoplasmic male sterility via TALEN-mediated mitochondrial genome editing, 2019, 5(7): 722–730.

[6] Mok BY, de Moraes MH, Zeng J, Bosch DE, Kotrys AV, Raguram A, Hsu F, Radey MC, Peterson SB, Mootha VK, Mougous JD, Liu DR. A bacterial cytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing, 2020, 583(7817): 631–637.

[7] Ran FA, Cong L, Yan WX, Scott DA, Gootenberg JS, Kriz AJ, Zetsche B, Shalem O, Wu XB, Makarova KS, Koonin EV, Sharp PA, Zhang F.genome editing usingCas9, 2015, 520(7546): 186–191.