張文通，李金祥，魏 鳳，李 峰，沈志強(qiáng)，

(1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.河北孟村回族自治縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河北 孟村 061400；3.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600）

豬血凝性腦脊髓炎（Porcine hemagglutinating encephalomyelitis,PHE）是由冠狀病毒屬的血凝性腦脊髓炎病毒（Hemagglutinatingenc ephalomyelitis virus, HEV）引起的一種急性、接觸性傳染病[1-2]。主要感染幼豬，以嘔吐、食欲廢絕、便秘、進(jìn)行性消瘦、腹瀉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙為特征，臨床上也稱之為仔豬嘔吐-消瘦病，病死率高達(dá)20%～100%。1958年該病在加拿大的安大略省首次暴發(fā)，此后在世界各主要養(yǎng)豬國家都相繼發(fā)生。我國于1985年在北京郊區(qū)某種豬場首次報道發(fā)生HEV感染。趙傳博等應(yīng)用血凝抑制試驗（HI）檢測遼寧省部分地區(qū)豬血清中HEV抗體陽性率高達(dá)44.0%[3]；劉立卓等應(yīng)用HI方法對從山東省部分地區(qū)采集的178份豬血清樣品進(jìn)行了HEV抗體檢測，HI抗體總體陽性率高達(dá)61.24%[4]。由此可見該病在養(yǎng)豬場感染很普遍，對養(yǎng)豬業(yè)威脅嚴(yán)重，但很多養(yǎng)豬場乃至基層從事養(yǎng)豬科研工作者對該病都很陌生。因此對該病相關(guān)實驗室檢測研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，很有必要。

防治該病的關(guān)鍵措施之一是對該病病原的確診。該病在癥狀上與豬偽狂犬病、豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征等相類似，僅憑流行病學(xué)調(diào)查、臨床及剖檢診斷無法鑒別，確診必須依靠實驗室診斷。自20 世紀(jì)50 年代末期首先發(fā)現(xiàn)該病以來，科研工作者對該病實驗室診斷方法進(jìn)行了大量的研究，取得了顯著成績。文章就該病實驗室診斷方法研究進(jìn)展進(jìn)行了如下綜述。

1 病毒分離鑒定

首先采集疑似HEV 感染病豬的腦、脊髓、呼吸道分泌物等組織；將病料組織研磨，反復(fù)凍融，過濾除菌處理；接種于長滿單層的易感細(xì)胞如豬腎原代細(xì)胞單層或甲狀腺單層細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)72 h，觀察有無融合細(xì)胞出現(xiàn)。如果有HEV 存在，即可在接種后24 h 至48 h 出現(xiàn)融合細(xì)胞。最后將分離后的細(xì)胞病毒液收集后，反復(fù)凍融，透射電鏡觀察病毒粒子形態(tài)應(yīng)呈典型的 冠狀病毒”。

2 血清學(xué)診斷

2.1 血清中和試驗

首先將待檢血清56 ℃ 30 min進(jìn)行滅活；將PHEV 病毒液與不同稀釋濃度的待測血清按照1:9 均勻混合，37 ℃溫箱孵育1 h；將每個滴度混合后的懸液加入到長滿單層的胎豬腎細(xì)胞的試管中；培養(yǎng)72 h后，檢測培養(yǎng)液的雞紅細(xì)胞的凝集活性。以此來檢測病毒是否在細(xì)胞上增殖。通常把中和抗體的效價1:8或更高，可判為陽性，否則判為陰性。

2.2 血凝抑制試驗

血凝抑制試驗主要用于檢測待檢血清對紅細(xì)胞凝集的抑制情況。在此試驗中，通常要設(shè)定已知的陰性血清、陽性血清、紅細(xì)胞、抗原以及不加抗原的待檢血清作為對照，同時，要在保證各對照孔沒有錯誤的情況下，對結(jié)果進(jìn)行評價和分析；最后以結(jié)果中出現(xiàn)完全抑制的血清稀釋倍數(shù)為HI 效價。應(yīng)用本法檢查被檢血清的紅細(xì)胞凝集抑制價在1:40 以上判為陽性。周鐵忠等用HI 檢測遼寧各地區(qū)HEV 感染情況，結(jié)果顯示陽性率為49.6%[5]。賀文琦等應(yīng)用HI 檢測了從吉林省部分地區(qū)采集的豬血清中HEV 抗體，陽性率高達(dá)44.3%[6]。HI 方法的建立，對PHEV 的診斷和防治是一種非常實用的技術(shù)手段。

2.3 瓊脂擴(kuò)散試驗

首先制作瓊脂糖平皿，然后分別在中間和周圍打孔（中央孔與周圍孔的間距一般以3 mm 為宜）。在中間的孔中加入抗原，待檢血清、陰性和陽性血清分別加入到周圍孔中；將瓊脂糖平板放置濕盒內(nèi)，然后將濕盒置于37 ℃條件下培養(yǎng)24～48 h，觀察特異性沉淀線。如果抗原與待測血清產(chǎn)生的沉淀曲線與抗原與陽性對照的血清作用產(chǎn)生的沉淀線相融合，則可判斷該待測血清為陽性，不出現(xiàn)線則為陰性。該方法操作簡單，可以用于PHEV 血清抗體的流行病學(xué)調(diào)查。

2.4 酶聯(lián)免疫吸附測定法

酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）原理是采用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測物與酶連接，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定性或定量測定。測定的對象可以是抗體也可以是抗原。其方法簡單，方便訊速，特異性強(qiáng)，敏感度高，已在多個領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

趙傳博等用HEV 的單克隆抗體作為檢測抗體、HEV 的多抗作為捕獲抗體，建立了檢測HEV 的抗原捕獲ELISA 方法，抗原捕獲ELISA 陽性檢出結(jié)果與PCR 方法相一致[7]。單長見等以HEV 純化的N 重組蛋白作為包被抗原，建立檢測HEV 血清抗體的間接ELISA 方法，用該法對天津市地區(qū)采集到的200 份豬血清樣品進(jìn)行檢測，陽性檢出率為83.5%[8]；劉立卓等以純化HEV 為包被原建立檢測HEV 血清抗體的間接ELISA 方法，應(yīng)用該ELISA 方法對從山東地區(qū)豬血清中隨機(jī)抽取的44 份樣品檢測HEV 抗體陽性率為72.73%[4]。

3 分子生物學(xué)檢測技術(shù)

目前運用于檢測HEV 的分子生物學(xué)檢測技術(shù)主要是RT-PCR 技術(shù)和熒光定量PCR 檢測技術(shù)。

RT-PCR 即逆轉(zhuǎn)錄PCR，是將RNA 的逆轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA 的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)相結(jié)合的技術(shù)。RT-PCR 技術(shù)優(yōu)點是靈敏，缺點是易被污染。該方法已經(jīng)得到了比較廣泛的應(yīng)用。常靈竹等根據(jù)GenBank中登錄HEV 的HE 基因和S 基因設(shè)計了1 對引物，建立快速檢測HEV的RT-PCR 方法，檢測與HEV 親緣性較高的牛冠狀病毒及豬的偽狂犬病毒均為陰性，最低可以檢測到10個TCID50/100 μL 的病毒，說明該方法的有較好的特異性和敏感性[9]。

熒 光 定 量PCR 是1996 年 由美國Applied Biosystems 公司推出的一種新定量試驗技術(shù)，它是通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實時在線監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對產(chǎn)物進(jìn)行分析，計算待測樣品模板的初始濃度。臧德躍等根據(jù)GenBank 中的HEV 的S 蛋白基因保守序列設(shè)計合成1 對特異性引物，建立了檢測HEV 的SYBRGreen Ⅰreal-time PCR 方 法；應(yīng)用該方法對采集的20 份疑似HEV感染病料進(jìn)行檢測，其中16 份為陽性，而用常規(guī)PCR 檢測同樣的樣品，僅8 份為陽性，由此可見該方法較常規(guī)PCR 方法敏感得多[10]。

HEV 主要侵害1 ～3 周齡乳豬，被感染仔豬發(fā)病率和死亡率都達(dá)100%。成豬一般為隱性感染，但可排毒。對發(fā)病仔豬進(jìn)行HEV 診斷及對成豬隱性帶毒HEV 篩查均依靠HEV 實驗室診斷。文章對HEV實驗室診斷方法研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，對開展HEV 綜合防控研究提供了詳實的資料。