彭張明，陳妃業(yè)，蒲桂川

（1.海南海壹水產(chǎn)種苗有限公司，海南 海口 571126；2.湛江海壹水產(chǎn)種苗有限公司，廣東 湛江 524025）

微孢子蟲Microsporidia 是一種可感染多種真核生物的專性細(xì)胞內(nèi)寄生蟲，目前被認(rèn)為是真菌的姐妹群（sister group）[1]。自19 世紀(jì)第一次在家蠶中發(fā)現(xiàn)微孢子蟲Nosema bombycis 以來，到目前為止,其仍然是導(dǎo)致養(yǎng)蠶業(yè)巨大經(jīng)濟(jì)損失的致命性微粒子病的主要病原[2，3]。在養(yǎng)殖泰國黑虎蝦（又稱斑節(jié)對蝦）Penaeus monodon 和凡納濱對蝦Litopenaeus vannamei 中先后報道了兩種對蝦微孢子蟲感染病例，分別是對蝦八孢蟲Agmasoma penaei 和蝦肝腸胞蟲（Enterocytozoon hepatopenaei，EHP）。對蝦八孢蟲主要感染結(jié)締組織和肌肉，使肌肉纖維退化衰退，使對蝦通體呈乳白色，而EHP 主要寄生在對蝦的肝胰腺組織中[4-7]。近年來，其他八個種對蝦微孢子蟲也在對蝦養(yǎng)殖中被發(fā)現(xiàn)[8-15]。王元等[16]在國內(nèi)首次報道了一種微孢子蟲感染脊尾白蝦Exopalaemon carinicauda 的臨床癥狀，分析了該病原的形態(tài)結(jié)構(gòu)、寄生部位以及造成的病理變化。隨著該疾病的流行與傳播，自2009 年以來亞洲主要對蝦養(yǎng)殖區(qū)域（如泰國、中國、印度、越南、印度尼西亞和馬來西亞等）均有報道，2017 年委內(nèi)瑞拉也報道了該疾病，現(xiàn)已對全球?qū)ξr養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)構(gòu)成了威脅，使全世界的對蝦養(yǎng)殖業(yè)受到巨大損失[5,17-19]。

本文概述與分析了EHP 與HPM 的發(fā)生與流行、臨床體征與病理特征、致病機(jī)理、診斷方法及防控措施等，以期為進(jìn)一步研究HPM 和其他蝦類疾病提供參考。

1 發(fā)生與流行

1.1 對蝦HPM 的發(fā)現(xiàn)與傳播

Pasharawipas 等[20]于1994 年首次報道印度Chennai（金奈）地區(qū)斑節(jié)對蝦的結(jié)締組織和肌肉感染了對蝦八孢蟲，隨后Lightner[21]也報道了美國佛羅里達(dá)州對蝦八孢蟲對肌肉組織的感染。2009 年和2013 年，Tourtip 等[6]和Tangprasittipap[5]分別報道了EHP 感染泰國地區(qū)的斑節(jié)對蝦和凡納濱對蝦的研究。隨后，同樣的微孢子蟲感染問題波及到了亞洲許多國家。在泰國研究發(fā)現(xiàn)，對蝦八孢蟲不能通過孢子或同類相食在養(yǎng)蝦池中水平傳播，因此可采取將孵化池、養(yǎng)殖池中的魚類等疑似宿主徹底清除的控制策略，大幅降低“棉花蝦”的流行率[22，23]。而EHP可以通過孢子和嗜食同類進(jìn)行水平傳播[5,24]，即便是養(yǎng)殖池塘中對蝦糞便中釋放的孢子，也是可以讓對蝦感染EHP，因此要徹底清除孢子需要花費大量時間和昂貴代價，控制EHP 更加困難，所以，EHP是目前引起HPM 最重要的病原，EHP 的發(fā)生和流行已成為全球?qū)ξr養(yǎng)殖業(yè)中高度重視和亟待解決的問題。

1.2 對蝦HPM 的流行與危害

病原傳播是水產(chǎn)養(yǎng)殖面臨的主要問題，例如在泰國，EHP 引起的HPM 已經(jīng)成為繼白斑?。╳hite spot disease，WSD）和急性肝胰腺壞死?。╝cute hepatopancreatic necrosis disease，AHPND）后影響泰國對蝦養(yǎng)殖的第三個最棘手的問題[25]。在亞洲和南美洲的一些國家，對蝦養(yǎng)殖為國民收入做出了重要貢獻(xiàn)，對蝦養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展促進(jìn)了亞洲當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)繁榮，每年的出口收入達(dá)數(shù)十億美元，然而在印度，2018 年對蝦微孢子蟲（EHP）在對蝦養(yǎng)殖中的流行，對蝦減產(chǎn)10%～20%[26,27]。中國自2013 年首次發(fā)現(xiàn)EHP 以來，主要的對蝦養(yǎng)殖區(qū)域先后都發(fā)現(xiàn)HPM的流行，中國漁業(yè)報[28]報道浙江省2015 年上半年凡納濱對蝦蝦苗EHP 攜帶率為23.1%。王博雅等[29]抽樣分析得到，2015 年遼寧省26 個凡納濱對蝦病樣中EHP 檢出率為34.6%。陳祿芝等[30]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，2016 年粵西地區(qū)對蝦樣品的EHP 檢出率為41.38%，從2017 年湛江市的EHP 流行情況來看，隨機(jī)抽取的蝦樣品EHP 陽性率也達(dá)到了30%[31]。申紅旗等[32]調(diào)查發(fā)現(xiàn)：2017 年河北省南美白對蝦EHP 引起HPM 的發(fā)病率為3.58%，實際發(fā)病率應(yīng)高于書面調(diào)查數(shù)據(jù)。2015—2017 年許杰等[33]在天津市采集養(yǎng)殖對蝦及餌料生物樣品中EHP 的陽性率依次為56.96%、69.52%和29.28%，可見2017 年天津市EHP流行率呈顯著下降趨勢。2015—2016 年，江蘇如東地區(qū)大面積養(yǎng)殖的對蝦出現(xiàn)嚴(yán)重滯長現(xiàn)象，致使該地區(qū)凡納濱對蝦減產(chǎn)15%～30%。抽樣檢測發(fā)現(xiàn)：滯長蝦EHP 的小亞基（small subunit ribosomal RNA，SSU rRNA）基因幾乎全部陽性[34]。

2 臨床體征與病理特征

2.1 感染EHP 的對蝦HPM 臨床體征

對蝦感染EHP 導(dǎo)致HPM 后一般不會引起對蝦死亡，可正常攝食，腸胃充滿食物，與正常對蝦幾乎沒有區(qū)別，但是，生長明顯緩慢，規(guī)格差異顯著，飼料系數(shù)升高[35]，嚴(yán)重時腸道發(fā)炎，肝胰腺萎縮、發(fā)軟，行動遲緩，個別蝦還有白便現(xiàn)象[36]。實驗結(jié)果顯示，感染EHP 的5 日齡凡納濱對蝦苗，肝胰腺開始變色；30 日齡后，蝦苗生長遲緩，個別發(fā)現(xiàn)白便現(xiàn)象。需說明的是，蝦苗的飼料顏色與肝胰腺的顏色變化有關(guān)，因此，在蝦苗未被證實感染EHP 之前，通過觀察蝦苗肝胰腺顏色變化來判斷蝦苗是否感染EHP 沒有意義[36]。EHP 感染還將導(dǎo)致對蝦變瘦，重量降低，這也直接影響對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量[37]。

2.2 感染EHP 的對蝦HPM 病理特征

對蝦HPM 的組織病理表明：在肝胰腺中可見早期孢原質(zhì)（early sporogonal plasmodia）、后期孢殖團(tuán)（late plasmodium）和成熟孢子（mature spores）等[6,36]。取對蝦肝胰腺進(jìn)行熒光原位雜交試驗（fluorescent in situ hybridization，F(xiàn)ISH），在電子顯微鏡下可觀察組織病理與EHP 不同的孢子發(fā)育階段[24]。凡納濱對蝦感染EHP 后，肝胰腺小管上皮細(xì)胞中存在明顯雜交信號[17]。施惠等[38]剖檢EHP 感染的凡納濱對蝦組織，發(fā)現(xiàn)鰓和肌肉未見明顯病理變化，而肝胰腺出現(xiàn)明顯病理體征，如可觀察到大量（1.3±0.2）μm×（0.8±0.2）μm 的EHP 孢子顆粒；肝胰腺腔體變小或消失，細(xì)胞腫大，肝胰腺上皮細(xì)胞腫大，細(xì)胞核壞死、消失；肝胰腺上皮細(xì)胞出現(xiàn)局灶性壞死或脫落，細(xì)胞中存在不同階段的EHP 孢子。趙若恒等[39]采用差速離心和密度梯度離心方法，從感染蝦肝腸胞蟲對蝦的肝胰腺中純化出了孢子，用透射電鏡、熒光桃紅染色觀察、血球計數(shù)板計數(shù)純化出的孢子。電鏡觀察表明：孢子為大小在0.7～1.2 μm 的橢圓形。蔗糖密度梯度離心等方法研究發(fā)現(xiàn)，江蘇如東地區(qū)對蝦EHP 孢子大小約為1.7 μm×0.9 μm，外壁上有大量白色瘤狀物，疑似胞壁蛋白，孢子表面布滿細(xì)小褶皺，孢子具有一個細(xì)胞核，極絲4～6 圈，細(xì)胞壁由一薄的電子透亮的孢子內(nèi)壁和電子致密的孢子外壁組成[34]。這些研究直接說明了EHP 存在的巨大危害性，而對蝦八孢蟲、匹里蟲Pleistophora 和微粒子蟲Nosema 等在對蝦養(yǎng)殖中鮮有報道，間接表明這些種類不是導(dǎo)致對蝦HPM 主要的致病原。

3 致病機(jī)理

3.1 EHP 的傳播途徑及侵染機(jī)制

共生及飼喂實驗證明，EHP 可通過養(yǎng)殖水體傳播，以及攝食寄生EHP 的鮮活餌料、病蝦、死蝦而感染，即所謂的水平傳播[5,24]。丁慧昕等[40]初步證明：EHP 一旦在養(yǎng)殖水環(huán)境中存在，即可通過流水分布于養(yǎng)殖環(huán)境中，還可以在其他水生生物體內(nèi)存活，健康蝦可以通過攝食寄生EHP 的病死蝦或養(yǎng)殖水環(huán)境中的孢子體而感染。而對EHP 垂直傳播，即通過親蝦傳播給子代，目前暫未見報道。EHP 是一種專性、細(xì)胞內(nèi)的寄生蟲，其侵染細(xì)胞時需要一系列合適的條件。普遍認(rèn)為，在感染第一步，EHP 孢子壁上的蛋白與宿主細(xì)胞的糖胺聚糖相互作用，然后在適合的條件下，極管通過擠壓穿透宿主細(xì)胞膜。該過程2 ms 內(nèi)就能完成，最后極管作為導(dǎo)管將具感染性的孢子體轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中，進(jìn)入寄生細(xì)胞內(nèi)階段[41-43]。測定發(fā)現(xiàn)，感染EHP 的凡納濱對蝦血淋巴中總蛋白、白蛋白含量、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和堿性磷酸酶活性等生化參數(shù)均顯著高于正常蝦[44]。

3.2 EHP 的增殖與致病

對蝦肝胰腺為EHP 提供了最適宜的寄生增殖條件，與其胞內(nèi)寄生生活相適應(yīng)。EHP 在進(jìn)化過程中失去了合成ATP（糖酵解）的功能，而該功能是真核生物產(chǎn)生ATP 的基本通路之一，因此，EHP 只能直接從宿主細(xì)胞獲得能量，維持其生長繁殖、能量代謝，從而影響宿主的能量代謝[45]。劉珍等[46]用實時熒光定量PCR（qPCR）研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)對蝦肝胰腺中EHP SSU rRNA 的相對拷貝數(shù)在103copies/（ng Hp DNA）數(shù)量級或EHP 載量指數(shù)在3 以上時，表現(xiàn)出EHP 較高的風(fēng)險水平，且對蝦EHP 的載量指數(shù)與對蝦生長速率呈負(fù)相關(guān)，但在較低的差異范圍內(nèi)，EHP 載量與對蝦生長的相關(guān)性不明顯。程東遠(yuǎn)[47]用實時熒光定量PCR 檢測已感染EHP 對蝦不同組織中EHP 的含量，結(jié)果顯示：肝胰腺＞中腸＞血淋巴＞鰓＞肌肉。原位雜交得到：EHP 主要感染肝胰腺，其他組織中EHP 含量較低。徐勝威等[48]用熒光定量PCR 技術(shù)分析得到，氨氮在一定濃度范圍內(nèi)可以有效控制EHP 的攜帶量。養(yǎng)殖水體氨氮濃度為6.0～9.0 mg/L 時，可以有效減少凡納濱對蝦EHP 的攜帶量，為凡納濱對蝦的養(yǎng)殖提供了一個重要的指導(dǎo)方向。從以上可知，EHP 導(dǎo)致對蝦HPM 的致病能力非常強，當(dāng)蝦體中EHP 的含量超過一定數(shù)值后，對蝦的危害不言而喻。鑒于此，未來針對EHP 建立的細(xì)胞感染模型將會成為探究EHP 致病機(jī)理的重要方向，進(jìn)而得到有效避免EHP 傳播和感染的方法和措施。

4 診斷方法

4.1 EHP 檢測方法的發(fā)展

對蝦感染EHP 引起的HPM 沒有明顯或特定的臨床癥狀，加之又恰逢2006 年亞洲地區(qū)AHPND 的大規(guī)模爆發(fā)，導(dǎo)致EHP 感染早期階段沒有引起足夠的重視，在全球的斑節(jié)對蝦和凡納濱對蝦養(yǎng)殖中廣泛傳播，對蝦生長緩慢的問題越來越普遍，經(jīng)濟(jì)損失越來越嚴(yán)重，直接或間接地威脅著整個對蝦養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[49,50]。隨著人們對EHP 的認(rèn)識不斷深入，其診斷方法也迅速發(fā)展，出現(xiàn)了一大批EHP 的診斷技術(shù)與檢測方法，極大地促進(jìn)了EHP 防控技術(shù)和生物安保理念的發(fā)展。EHP 的診斷方法主要包括兩大類，一類是無法進(jìn)行定量情況下，只能定性描述病原微生物，例如組織病理和細(xì)胞病理學(xué)觀察、常規(guī)PCR 分析、套式PCR（nested PCR）、環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（LAMP）和地高辛標(biāo)記核酸探針原位雜交等[5,50-52]；另一類EHP 的定量檢測，主要是實時熒光定量PCR，包括SYBR GreenⅠ熒光染料qPCR 和TaqMan探針qPCR[53,54]。

4.2 病原的診斷方法

4.2.1 染色鏡檢法

EHP 的定性診斷方法中，組織病理和細(xì)胞病理觀察需要借助光學(xué)或電子顯微鏡。EHP 屬于胞內(nèi)寄生，其大小約為0.75～1.0 μm，個體非常小，病理觀察時通常借助組織切片[50]。電鏡下，可在肝胰腺上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)從早期孢原質(zhì)到成熟孢子的不同發(fā)育階段的EHP[24]。常曉晴等[55]用8 種染色方法觀察了感染EHP 的凡納濱對蝦肝胰腺的組織病理切片。結(jié)果顯示：Masson 染色法對組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)染色效果較好，檢出率也最高，非常適用于組織內(nèi)EHP 孢子的染色觀察。

4.2.2 現(xiàn)代分子生物學(xué)檢測工具

目前所使用的分子工具，包括常規(guī)PCR、套式PCR、LAMP 及原位雜交對EHP 的診斷，都是通過核酸以SSU rRNA 基因的序列為目的基因來確定[50-52]，但是，與海洋生物中密切相關(guān)的微孢子蟲SSU rRNA 序列可能會對EHP 產(chǎn)生假陽性，例如寄生在魚和鹵蟲中的某些微孢子蟲，若以此魚和鹵蟲作為蝦飼料時，SSU-PCR 方法就有可能導(dǎo)致抽樣該飼料及親蝦糞便進(jìn)行PCR 檢測時出現(xiàn)EHP 假陽性的結(jié)果，造成一些不必要損失[52]?；诖?，推薦利用基于EHP 的孢壁蛋白（EhSWP1）基因序列建立的一種更為特異的套式PCR 檢測方法，稱為SWP-PCR，其在PCR 第一步反應(yīng)中比SSU-PCR 更敏感，總體上更具辨別力[52]。葉健等[56]采集不同樣本通過3 種PCR 方法檢測EHP，結(jié)果表明18S-PCR 在第一步擴(kuò)增的靈敏度最好，SSU-PCR在第二步擴(kuò)增的靈敏度顯著高于SWP-PCR，但存在著一定的假陽性現(xiàn)象，建議檢測凡納濱對蝦苗種的蝦肝腸胞蟲時，宜采用靈敏度更高的套式。除此之外，基于EHP 的孢壁蛋白，運用免疫電鏡（Immunoelectron analysis，IEM）進(jìn)行亞細(xì)胞定位，也可以準(zhǔn)確定位EHP 的存在[57]。

4.3 EHP 的定量檢測方法

4.3.1 熒光定量PCR（qPCR）檢測方法

EHP 的定量檢測診斷中，SYBR GreenⅠ熒光染料qPCR 和TaqMan 探針qPCR 的引物設(shè)計也是基于EHP SSU rRNA，并以含有一定量的EHP SSU rRNA 靶片段的重組質(zhì)粒DNA 為標(biāo)準(zhǔn)模板[46,53]。實際應(yīng)用中，TaqMan 探針法具有更高的檢測特異性，但是，檢測費用高。SYBR GreenⅠ熒光法的檢測成本低且操作簡單，因此，更加廣泛地應(yīng)用于快速檢測，但SYBR GreenⅠ熒光染料qPCR 缺乏特異性熒光探針，可能產(chǎn)生引物二聚體和非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的干擾，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，甚至產(chǎn)生假陽性結(jié)果[53]。TaqMan 探針qPCR 相比SYBR GreenⅠ擁有更高的敏感性和特異性，一次反應(yīng)最低，檢測病原含量靈敏度可以達(dá)到4×101copies，在國際獸疫局（OIE）對水生動物對蝦病原體診斷標(biāo)準(zhǔn)中，該法經(jīng)常作為12 種病原體定量檢測的標(biāo)準(zhǔn)方法[53,58]。

4.3.2 國內(nèi)EHP 定量檢測方法建立

國內(nèi)開展了眾多EHP 定量檢測研究，報道了所建立方法的穩(wěn)定性、重復(fù)性、敏感性及應(yīng)用情況[54,59,60]，張娜等[61]針對EHP 18S 相關(guān)保守序列設(shè)計了1 對特異性引物，優(yōu)化并建立了EHP 的Taqman 熒光PCR 檢測方法，所建方法重復(fù)性較好，在模板濃度為6.5×102copies/μL DNA 時，仍有較強熒光信號，較普通PCR 方法檢測靈敏度至少高出1 個數(shù)量級；黃紀(jì)徽等[62]采用一種新型的等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)——重組酶介導(dǎo)擴(kuò)增（recombinase-aid amplification，RAA）技術(shù)檢測EHP，基于EHPSSUrDNA 序列，建立快速檢測EHP 的RAA 恒溫?zé)晒鈾z測方法，RAA 進(jìn)行到24 個循環(huán)反應(yīng)時可以檢測最小濃度10 copies/μL 的質(zhì)粒，相當(dāng)于10 個病毒粒子。

鑒于目前養(yǎng)殖對蝦的肝胰腺組織中未報道被EHP 以外的微孢子蟲感染，因此，針對對蝦肝胰腺組織的EHP 檢測，基于SSU rRNA 基因序列的相關(guān)SSU-PCR 檢測仍然是可信的方法，但是檢測糞便、餌料生物、飼料以及環(huán)境中潛在的EHP 時，推薦使用SWP-PCR[52]。

5 防控措施

5.1 切斷EHP 易感途徑

目前還沒有確定的藥物可以治療感染EHP 導(dǎo)致HPM 的對蝦，因此首要措施是預(yù)防。在對蝦養(yǎng)殖過程中要認(rèn)真檢查重要的易感環(huán)節(jié)，首先是種源，對親蝦和苗種進(jìn)行EHP 檢測；其次是投喂飼料，控制餌料投喂，監(jiān)測養(yǎng)殖水體的EHP；最后是關(guān)注行業(yè)對蝦的疫情檢測等，通過以上措施來控制EHP 的傳播和感染。具體來說，推薦按照最佳管理措施（best management practices，BMPs）開展對蝦種苗繁育與養(yǎng)殖工作[63]。例如育苗前用pH1 左右的鹽酸溶液或pH＞11 的堿性溶液消毒所有育苗工具，晾曬干燥5d 以上，全力保證所培育的蝦苗為無特定病原（specific pathogen free，SPF）的苗種；高位養(yǎng)殖池塘用高濃度有效氯或高錳酸鉀溶液徹底消毒，一般的土池塘底要用生石灰充分消毒和晾曬；PCR 檢測蝦苗確保不攜帶有EHP 病原；盡量避免投喂鮮活餌料，可將鮮活餌料置于-20℃以下冰凍或者巴氏滅菌法處理后再投喂。

5.2 嚴(yán)格把好苗種質(zhì)量關(guān)

對蝦苗種行業(yè)更需要重視蝦苗培育過程中的EHP 防控。在高密度工廠化育苗過程中，蝦苗感染EHP 的幾率和風(fēng)險遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于低密度的成蝦養(yǎng)殖。已發(fā)現(xiàn)的各種致病微生物感染蝦，早期蝦苗比養(yǎng)殖中晚期更易被感染，且被EHP 感染的蝦苗極具威脅性，養(yǎng)殖成功率下降。因此，選擇蝦苗的首要標(biāo)準(zhǔn)是未攜帶EHP 病原的蝦苗。對檢測確診感染了EHP的蝦苗，應(yīng)在育苗場進(jìn)行無公害化處理，嚴(yán)禁蝦苗流入市場。

6 總結(jié)與展望

在對蝦養(yǎng)殖過程中，隔離病原體是一種有效控制病原傳播的方法，但它需要對受感染的動物進(jìn)行早期鑒定，快速診斷，用適當(dāng)?shù)目股鼗蚩刂浦虏〔≡w以減輕損失[64]。而EHP 作為一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生蟲，是對蝦HPM 最重要的致病原，對蝦一旦感染了EHP 目前還沒有有效藥物能夠治療，從養(yǎng)殖的各個環(huán)節(jié)預(yù)防EHP 的感染和傳播是重中之重。鑒于此，對蝦育苗企業(yè)需要義不容辭地對蝦苗EHP 的生物安全擔(dān)當(dāng)與負(fù)責(zé)，堅持企業(yè)初心，為行業(yè)提供優(yōu)質(zhì)蝦苗、良心蝦苗。為更準(zhǔn)確、快捷診斷環(huán)境中EHP的存在，降低因SSU-PCR 檢測存在的假陽性，期待早日開發(fā)出基于EHP 孢壁蛋白（EhSWP1）基因序列的實時熒光定量PCR 的檢測方法，為預(yù)防EHP的傳播提供準(zhǔn)確方向，期待借助EHP 侵染宿主的機(jī)制開發(fā)出預(yù)防及治療EHP 的方法。