李天芝

（山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600）

豬鼻支原體（Mycoplasma hyorhinis,Mhr）無細胞壁，大小介于細菌和病毒之間，具有高度可變的多種形態(tài)，可在細胞內(nèi)寄生，也能在體外培養(yǎng)基純培養(yǎng)，但初次分離難度大。Mhr是細胞培養(yǎng)過程中常見污染源，也與人類肺癌、胃癌、乳腺癌、大腸癌等多種癌癥具有相關(guān)性，Mhr具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。Mhr對外界環(huán)境抵抗力弱，常規(guī)消毒劑即可迅速殺滅。Mhr感染豬后能引起豬肺炎、多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎、結(jié)膜炎、中耳炎等多種疾病[1]，3～10周齡仔豬多發(fā)[2]，一年四季均可發(fā)病，可造成豬生長發(fā)育緩慢，飼料報酬降低等，常與其它豬病混合感染，加重病情[3]。Mhr主要通過直接接觸和呼吸道飛沫傳播。Mhr是豬鼻腔、氣管、支氣管黏液中的常在菌，10%母豬和40%斷奶仔豬呼吸道黏液中均有該菌存在[4]，當(dāng)豬群密度大、通風(fēng)不良、飼料突變、轉(zhuǎn)群、斷奶或受到其它應(yīng)激時容易發(fā)病。Mhr作為一種條件性致病菌，長期被忽視，近年來，Mhr引起的疾病增加，對豬場危害嚴重。本文就近年來Mhr常規(guī)PCR法、套式PCR法、多重PCR、熒光PCR方法、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)等5種分子生物學(xué)檢測方法研究進展進行綜述，以期為該病的快速診斷和防控提供參考。

1 常規(guī)PCR法

PCR是以病原核酸為模板進行病原快速檢測的方法，較病原分離鑒定等傳統(tǒng)的方法，檢測速度快、靈敏度高，在動物疾病診斷上得到了廣泛的應(yīng)用。沈強等[5]建立一種可靠的Mhr PCR檢測方法，擴增Mhr目的基因大小為364 bp，最低可檢測模板濃度0.5 ng/mL的Mhr DNA含量，方法特異性好，與其它豬常見導(dǎo)致呼吸道和多發(fā)性漿膜炎病原無交叉反應(yīng)。李石友等[6]采集疑似Mhr的感染病豬肺臟并提取DNA作為模版，根據(jù)GenBank的數(shù)據(jù)庫中Mhr膜蛋白P37的序列設(shè)計1對特異性引物，建立Mhr PCR檢測方法。試驗結(jié)果顯示，擴增目的基因片段大小為494 bp，該法最低可檢測濃度為3.44×10-8ng/μL Mhr DNA含量，為快速準確鑒別Mhr提供了一種有效的臨診手段，也對藥物的使用具有指導(dǎo)意義。

2 套式PCR法

套式PCR，又稱巢式PCR。采用兩對引物擴增目的基因片段，第2對引物在第1對引物的內(nèi)部設(shè)計，以第1對引物的擴增產(chǎn)物為模板進行再次擴增，經(jīng)兩輪擴增，保證了擴增產(chǎn)物的特異性，提高了PCR檢測的敏感性。白方方等[7]應(yīng)用巢式聚合酶鏈式反應(yīng)建立了一種檢測Mhr的方法，試驗中以酚-氯仿法制備模板DNA，根據(jù)Mhr P37序列高度保守區(qū)設(shè)計2對引物，建立Nested PCR診斷方法。在特異性檢測試驗中，設(shè)計的引物不能擴增出豬絮狀支原體、豬滑液支原體、豬肺炎支原體、雞毒支原體、胸膜肺炎放線桿菌、豬瘟病毒、豬流感病毒、豬圓環(huán)病毒2型及豬繁殖與呼吸綜合征病毒等病原體。敏感性試驗表明，第1次PCR和第2次PCR的敏感度分別為3.01 mg/L和3.01×10-4mg/L。對41份臨床樣品肺組織的檢測中，普通PCR和巢式PCR的檢出率分別為 29.3%（12/41）和 82.9%（34/41）。彭凌等[8]根據(jù)Mhr P69基因序列設(shè)計2對引物，建立了Mhr套式PCR診斷方法，對建立的方法進行特異性、敏感性檢測，同時進行臨床檢測。結(jié)果表明，應(yīng)用建立的套式PCR方法對MhrDNA的檢出限為1.4×10-5ng/μL，與常見感染豬的細菌、病毒均無交叉反應(yīng)。利用建立的套式PCR方法對23份臨床樣品進行檢測，陽性檢出率為73.9%。

3 多重PCR法

多重PCR是一種特殊的PCR技術(shù)，它在同一PCR體系中，加入多對引物，同時檢測2種或2種以上的病毒DNA，它具有快速、靈敏度高、高效、特異性強等優(yōu)點而廣泛用于臨床的快速診斷。吳靜波等[9]根據(jù)副豬嗜血桿菌（HPS）的P2蛋白基因和Mhr的P37蛋白基因分別設(shè)計了1對引物，建立HPS和Mhr雙重PCR檢測方法，并進行特異性和靈敏度試驗，同時應(yīng)用所建立方法對臨床樣品進行檢測。結(jié)果顯示，該方法可特異性檢測出HPS和Mhr，對其他細菌無非特異性擴增，檢測靈敏度可達到100 copies，并可根據(jù)擴增產(chǎn)物的大小區(qū)分HPS P2蛋白基因的Ⅰ和Ⅱ兩個基因型，初步判定HPS的致病性。對32份呼吸道疾病臨床樣品的檢測結(jié)果顯示，HPS和Mhr陽性率分別為59.4%和53.1%，雙重感染的樣品為34.4%。劉茂軍等[10]根據(jù)豬肺炎支原體（MHP）和Mhr的16S rRNA基因設(shè)計3條引物，建立MHP和Mhr的雙重PCR檢測方法，并對該方法進行了特異性和敏感性試驗。應(yīng)用建立的方法檢測了臨床樣品和疫苗樣品。結(jié)果顯示，該方法具有良好的特異性，最低可檢測到0.66 ng的MHP基因組DNA和0.58 ng Mhr基因組DNA。臨床樣品和疫苗樣品檢測結(jié)果與普通PCR檢測結(jié)果一致。

4 熒光PCR方法

熒光PCR是在常規(guī)PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種高度靈敏的核酸定量技術(shù)，它融匯了傳統(tǒng)PCR技術(shù)靈敏、快速、特異的特點以及光譜技術(shù)的高敏感性和高精確定量的優(yōu)點，檢測速度快、敏感性高，可直接觀察擴增結(jié)果，不需要后續(xù)電泳檢測擴增產(chǎn)物，減少了對環(huán)境氣溶膠污染的可能，避免了假陽性結(jié)果。據(jù)信號基團的不同，實時熒光定量PCR可以分為染料法和探針法兩種。白方方等[11]根據(jù)GenBank中登錄的Mhr P37基因序列設(shè)計并合成引物及MGB探針，構(gòu)建含有P37基因的重組質(zhì)粒，以其為標準品繪制標準曲線，并檢測該方法的特異性、敏感性和重復(fù)性。結(jié)果顯示該方法具有良好的特異性，與豬肺炎支原體、豬絮狀支原體、豬滑液支原體、雞毒支原體、副豬嗜血桿菌、豬胸膜肺炎放線桿菌、豬圓環(huán)病毒、豬瘟病毒及豬流感病毒無交叉反應(yīng)，對Mhr的檢測敏感性為10 copies/μL，并且穩(wěn)定性好，變異系數(shù)小于2%。利用建立的熒光定量PCR方法對55份臨床樣品進行檢測，陽性檢出率為87.3%（48/55），而分離培養(yǎng)方法和普通PCR的陽性檢出率分別為41.8%（23/55）和29.1%（16/55）。武昱孜等[12]根據(jù)MHP P97序列和Mhr P37序列的特異性引物，分別標記FAM和Texas Red熒光報告基團的2條TaqMan探針，建立和優(yōu)化雙重實時熒光定量PCR反應(yīng)條件和體系，同時檢測其敏感性、特異性和重復(fù)性。建立的雙重?zé)晒舛縋CR對豬肺炎支原體和Mhr的最低檢測值均為10 copies/μL，與豬源致病菌、病毒和其他常見細菌均無交叉反應(yīng)，各濃度標準品的Ct值變異系數(shù)小于5%，重復(fù)性好。檢測72份臨床樣本，其中豬肺炎支原體的肺陽性率為80%，鼻拭子陽性率為22%，支氣管肺泡灌洗液陽性率為58.33%，Mhr的肺陽性率為40%，鼻拭子陽性率為66%，支氣管肺泡灌洗液陽性率為41.67%。

5 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP）方法是日本學(xué)者Notomi等發(fā)明的一種新的適用于基因診斷的恒溫核酸擴增技術(shù)，不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，一臺水浴鍋或恒溫箱就能實現(xiàn)反應(yīng)，結(jié)果可通過肉眼觀察白色渾濁或綠色熒光的生成來判斷，簡便快捷，具有靈敏度高、操作簡單、反應(yīng)時間短、臨床使用不需要特殊的儀器等優(yōu)點，特別適合在現(xiàn)場和基層部門應(yīng)用。劉博婷等[13]以Mhr的P37基因序列為靶基因，設(shè)計1組特異性引物，對反應(yīng)體系的引物濃度、MgSO4、dNTPs、反應(yīng)溫度和時間進行優(yōu)化，并進行了特異性和靈敏度試驗，旨在建立Mhr的簡便、快速、準確的分子檢測方法。同時應(yīng)用所建立的方法對臨床樣品進行檢測，結(jié)果顯示，最佳反應(yīng)體系為MgSO46 mmol/L，dNTPs 1.2 mmol/L， 內(nèi)引物（FIP/BIP）1.6 μmol/L，外引物（F3/B3）0.2 μmol/L，Bst DNA 聚合酶8 U，60℃擴增60 min。靈敏度是常規(guī)PCR的100倍，并且與其他病原菌無任何交叉反應(yīng)。對23份呼吸道疾病臨床樣品進行檢測的結(jié)果顯示，普通PCR和LAMP的檢出率分別為23.4%和79.6%。

6 小結(jié)

疾病的正確診斷是進行有效防控的前提和基礎(chǔ)，隨著規(guī)?；B(yǎng)殖的發(fā)展，臨床上的豬病變得越來越復(fù)雜，老病新發(fā)和疾病混感現(xiàn)象增加，很難通過臨床表現(xiàn)和眼觀病變診斷疾病，需要通過實驗室檢測進行精準診斷，從而及時采取有效的措施，降低損失。Mhr是豬只體內(nèi)的常在菌，當(dāng)豬受到應(yīng)激時，容易發(fā)病，近年來，引起了廣泛關(guān)注，可與多種疾病混感后繼發(fā)多種疾病，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。傳統(tǒng)的病原分離方法操作繁瑣，耗時長，對臨床疾病的診斷不實用，血清學(xué)方法不能判定是否現(xiàn)癥感染，只能說明豬只以前曾經(jīng)感染過Mhr，結(jié)合豬群表現(xiàn)出的臨床癥狀和病變表現(xiàn)，進行分子生物學(xué)檢測，是當(dāng)前診斷該病最可靠的方法。當(dāng)前有多種Mhr分子生物學(xué)檢測方法，但各有利弊，常規(guī)PCR方法雖然檢測速度快、特異性強，但不能定量，且檢測敏感性不高。熒光PCR方法雖然克服了常規(guī)PCR的缺陷，但儀器和探針的合成價格昂貴，檢測成本比較高，不適合基層應(yīng)用。LAMP方法雖然簡單、方便，適合基層進行推廣應(yīng)用，但靈敏度太高，易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，已經(jīng)出現(xiàn)了免核酸提取熒光PCR擴增技術(shù)、便攜式熒光PCR儀器及除模板外PCR組份凍干保存技術(shù)，如能應(yīng)用于Mhr分子檢測，必將開發(fā)出更方便、更快捷、成本更低的病毒分子檢測技術(shù)，方便疾病快速確診，從而更好地做好Mhr的防控工作。進行病料檢測時一定要選擇合適的病料樣品，活豬可采集鼻腔式子，具體做法為將棉簽伸入豬鼻中隔刺激，豬打3次噴嚏后，拔出棉簽，pH 7.4 PBS液中4℃冰箱浸泡過夜，10 000 r/min離心5 min，取沉淀提取基因組DNA。死亡豬可采集病變與健康交界處肺臟組織。針對Mhr無有效疫苗預(yù)防，雖可用林可霉素、大環(huán)內(nèi)酯類藥物治療，但容易產(chǎn)生耐藥性，效果不理想，只能采取綜合性防控措施，如加強飼養(yǎng)管理，提高豬只機體抗病力。飼喂優(yōu)質(zhì)全價配合飼料，不喂霉變飼料。豬舍加強保溫，保持豬舍清潔衛(wèi)生，做好消毒工作，定期通風(fēng)、降低氨氣濃度、減少飼養(yǎng)密度、減少應(yīng)激以降低Mhr相關(guān)疾病發(fā)病率和病情的嚴重程度。