許 晶，劉 虹，車星星，李素玲

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)山西功能食品研究院，山西太原030031）

白銀盤是山西管涔山地區(qū)一種著名的白色野生食用菌，因其盛產(chǎn)在入伏期即每年7月下旬到8月上旬，被當(dāng)?shù)厝朔Q為白銀盤或伏銀盤[1]。該蘑菇肉質(zhì)肥厚、味道鮮美、口感軟滑[2-3]，因此，深受當(dāng)?shù)卮迕駳g迎。白銀盤不僅可以食用，還具有多種藥用價(jià)值[4-8]。其子實(shí)體可治小兒麻疹、傷風(fēng)感冒、煩燥不安，因其能產(chǎn)生杯傘素（Clitocy bin）而具有抗肺結(jié)核病以及促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡的作用[9]；深層發(fā)酵生產(chǎn)的菌絲體及濾液中含有抗腫瘤活性成分，能夠增強(qiáng)人體免疫功能，在國際上被稱為生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑（Biolog ical response modifier，BRM）[10]。

目前，白銀盤市場價(jià)格在40～60元/kg不等，成為當(dāng)?shù)卮迕裰饕慕?jīng)濟(jì)來源之一。白銀盤的自然采集量已呈明顯下降趨勢，難以滿足市場需求。因此，開展野生白銀盤的馴化工作勢在必行[6]。目前，野生白銀盤人工馴化栽培的報(bào)道極少，對其的鑒定也主要以形態(tài)特征鑒別為主。

本研究利用從山西管涔山采集的野生白銀盤，在形態(tài)特征鑒定的基礎(chǔ)上對其進(jìn)行了分子鑒定，并對菌絲體進(jìn)行了生物學(xué)特性研究，以期為白銀盤的人工馴化栽培奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試樣本（LH170701） 野生白銀盤子實(shí)體2017年采自山西管涔山地區(qū)海拔1 800 m的云杉和落葉松混交林草地上，新鮮且無病蟲害。對樣本采用組織分離法獲得菌株材料，并經(jīng)純化后篩選生長旺盛的菌株作為研究材料。

PCR引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.1.2 母種培養(yǎng)基 馬鈴薯（去皮）200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨3 g，瓊脂粉20 g，磷酸二氫鉀3 g，硫酸鎂1.5 g，水1 000 mL。

1.1.3 平板培養(yǎng)基 葡萄糖20 g，蛋白胨3 g，瓊脂粉20 g，磷酸二氫鉀3 g，硫酸鎂1.5 g，維生素B10.03 g，硫酸鐵0.1 g，水1 000 mL。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定 在手持放大鏡和體視顯微鏡下進(jìn)行子實(shí)體宏觀特征觀察，主要觀察子實(shí)體的形狀、顏色、大小、菌蓋、菌柄及菌褶等。子實(shí)體的顯微結(jié)構(gòu)觀察在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行，用蒸餾水和3%KOH制作水封片，用棉蘭和Melzer試劑檢驗(yàn)擔(dān)孢子壁是否喜蘭以及淀粉質(zhì)的反應(yīng)。

1.2.2 分子鑒定 在北京首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室采用CTAB法提取樣本的DNA，PCR擴(kuò)增在FTGRAD2D型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行，ITS測序工作由北京中科希林生物技術(shù)有限責(zé)任公司完成。測序后ITS基因序列通過BLAST程序與GenBank數(shù)據(jù)庫中所收錄的ITS基因序列進(jìn)行同源性比對，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征對樣本進(jìn)行鑒定。

1.2.3 碳源試驗(yàn) 以平板培養(yǎng)基作為對照，分別以相當(dāng)碳量的果糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖和淀粉代替其中的葡萄糖，設(shè)6個(gè)處理，每個(gè)處理3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5個(gè)平板。

1.2.4 氮源試驗(yàn) 以平板培養(yǎng)基作為對照，分別以相當(dāng)?shù)康呐Ｈ飧唷⒔湍父?、麥麩、硫酸銨和尿素代替其中的蛋白胨，設(shè)6個(gè)處理，每個(gè)處理3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5個(gè)平板。

1.2.5 碳氮比試驗(yàn) 以平板培養(yǎng)基中的葡萄糖作為碳源，蛋白胨作為氮源，碳氮總量23 g，按照1∶1、5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1的碳氮比分別設(shè)置7個(gè)處理，每個(gè)處理3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5個(gè)平板。

1.2.6 溫度試驗(yàn) 在平板培養(yǎng)基中，設(shè)15、18、21、25、28、31℃共6個(gè)培養(yǎng)溫度處理，每個(gè)處理3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5個(gè)平板。

1.2.7 pH試驗(yàn) 用1 mol/L的鹽酸和氫氧化鈉對平板培養(yǎng)基進(jìn)行酸堿度調(diào)整，共設(shè)4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0等7個(gè)pH值，每個(gè)處理3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5個(gè)平板。

碳源、氮源、碳氮比和pH值試驗(yàn)的平板均在25℃恒溫下暗光培養(yǎng)7 d，溫度試驗(yàn)在不同的溫度下暗光培養(yǎng)7 d，每3 d進(jìn)行一次觀察和測量，計(jì)算菌絲的日生長速度。

1.3 數(shù)據(jù)分析

相關(guān)數(shù)據(jù)采用Excel 2003、SPSS 9.0、LSD法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)特征

擔(dān)子果中到大型，菌蓋生長初期呈扁半球形，后逐漸平展，中部下凹，后期直徑可達(dá)6～20 cm，表面光滑，無絨毛，邊緣整齊，無條紋，白色，有時(shí)中部呈淺黃白色；菌肉白色，厚實(shí)；菌褶白色，不等長，較密，直生或稍延生；菌柄圓柱狀，長5～8 cm，直徑2～4 cm，白色，表面平滑，中實(shí)；擔(dān)孢子橢圓形，（5.5～7.5）μm×（4～5）μm，無色，表面光滑，弱淀粉質(zhì)。

2.2 ITS-DNA測試比對結(jié)果

提取的ITS-DNA片段在NCBI上用BLAST比對結(jié)果顯示（表1），樣本（LH170701）與數(shù)據(jù)庫中的10個(gè)序列屬于同源序列，相似度都在97%以上，與來自美國序列KP453713的ITS相似度最高，為99%，結(jié)合形態(tài)學(xué)可以確定本研究采自中國山西管涔山地區(qū)的白銀盤是大白樁菇，學(xué)名是Aspropaxillus septentrionalis（Singer&Smith）Vizzini。

表1 白銀盤樣本的ITS片段在NCBI上BLAST結(jié)果

2.3 不同碳源對白銀盤菌絲生長的影響

碳源是食藥用菌生長所必需的營養(yǎng)物質(zhì)。由表2可知，不同碳源培養(yǎng)基上，白銀盤菌絲生長勢和生長速度呈極顯著差異。在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基上，菌落呈圓形而完整，菌絲潔白、粗壯、濃密、生長勢強(qiáng)，日生長速度最快，為3.58 mm/d，顯著高于其他的碳源；蔗糖和麥芽糖表現(xiàn)次之；果糖表現(xiàn)最差，菌絲乳白色、稀疏，生長勢極弱，日生長速度最慢，為2.55 mm/d。

表2 不同碳源對白銀盤菌絲生長的影響

2.4 不同氮源對白銀盤菌絲生長的影響

氮源是食藥用菌生長的第二大營養(yǎng)液。由表3可知，不同氮源菌絲的生長情況有著顯著差異。在以牛肉膏和酵母膏為氮源的培養(yǎng)基上，白銀盤的菌落圓形、完整，菌絲潔白、粗壯、濃密、生長勢強(qiáng)，日生長速度快，分別為3.58、3.31 mm/d，與其他氮源的差異達(dá)顯著水平；麥麩和硫酸銨表現(xiàn)次之；尿素表現(xiàn)最差，菌絲僅在接種塊周圍生長甚至不生長。

表3 不同氮源對白銀盤菌絲生長的影響

2.5 不同碳氮比對白銀盤菌絲生長的影響

從表4可以看出，白銀盤菌絲在碳氮比為（1∶1）～（30∶1）的培養(yǎng)基上均可生長，但生長速度存在顯著差異。在10∶1的培養(yǎng)基上生長勢最強(qiáng)，日生長速度最快，為3.67 mm/d，與其他碳氮比菌絲生長呈顯著差異；其次為5∶1和15∶1，二者差異不顯著，但與其他碳氮比菌絲生長呈顯著差異；表現(xiàn)最差的為1∶1和30∶1，菌絲稀疏、生長勢弱、生長速度最慢。

表4 不同碳氮比對白銀盤菌絲生長的影響

2.6 不同溫度對白銀盤菌絲生長的影響

從表5可以看出，白銀盤的菌絲在15～31℃下均可生長，但生長勢、日生長速度存在極大差異。菌絲最適宜的培養(yǎng)溫度為21～25℃，菌落濃密、菌絲粗壯、生長勢最強(qiáng)、日生長速度最快，分別為3.57、3.54 mm/d，與其他溫度下菌絲生長差異顯著；當(dāng)溫度低于21℃時(shí)，菌絲日生長速度隨溫度的升高逐漸加快，且生長勢趨好；當(dāng)溫度高于25℃時(shí)，菌絲生長速度隨溫度的升高逐漸減慢，且生長勢減弱。

表5 不同溫度對白銀盤菌絲生長的影響

2.7 不同pH值對白銀盤菌絲生長的影響

從表6可以看出，白銀盤在pH值5.0～8.0的范圍內(nèi)均可生長，但隨著pH值的升高，菌絲日生長速度呈現(xiàn)先升后降的趨勢，但以pH值7.0和pH值7.5表現(xiàn)最好，即菌絲生長勢最強(qiáng)、日生長速度最快，分別為3.62、3.70 mm/d，與其他pH值的菌絲生長差異達(dá)顯著水平；pH值低于5.0或高于7.5時(shí)，菌絲日生長速度顯著減慢；pH值4.0時(shí)菌絲不生長。

表6 不同pH值對白銀盤菌絲生長的影響

3 結(jié)論與討論

通過形態(tài)學(xué)和ITS-DNA序列鑒定，確定了在山西管涔山地區(qū)采集的野生白銀盤是隸屬傘菌目白蘑科樁菇屬的大白樁菇（Aspropaxillus septentrionalis）。

通過生物學(xué)特性研究可以看出，白銀盤菌絲生長的最適宜碳源是葡萄糖，其次是蔗糖和麥芽糖；適宜菌絲生長的最佳碳氮比為10∶1，其次為5∶1和15∶1；最適宜的pH值為7.0～7.5；適宜菌絲生長的溫度為21～25℃。

在氮源培養(yǎng)基中，牛肉膏、酵母膏、麥麩和硫酸銨對菌絲的生長都優(yōu)于蛋白胨，最適宜的氮源是牛肉膏和酵母膏，其次是硫酸銨；說明有機(jī)氮源和無機(jī)氮源對白銀盤菌絲生長都有不同程度的促進(jìn)作用。