杜璞 李永生
摘? ? ? 要: 辣根過(guò)氧化物酶(HRP)已被廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域,但其價(jià)格昂貴且不易保存,所以尋找一種可替代HRP的模擬酶意義重大。本研究初步選擇血紅蛋白(Hb)作為模擬酶,利用流動(dòng)注射光度系統(tǒng)(SP-FIA),在非平衡狀態(tài)下對(duì)比了Hb與HRP對(duì)H2O2/愈創(chuàng)木酚(GA)反應(yīng)的動(dòng)態(tài)催化性能。結(jié)果表明:Hb在弱酸性及高溫環(huán)境下其穩(wěn)定性強(qiáng)于HRP;Hb對(duì)H2O2/GA反應(yīng)體系的催化作用符合米氏方程,可作為一種過(guò)氧化物模擬酶使用;在動(dòng)力學(xué)研究中發(fā)現(xiàn),Hb對(duì)GA和H2O2的催化活性不及HRP,對(duì)GA的親和力強(qiáng)于HRP,對(duì)H2O2的親和力弱于HRP。干擾實(shí)驗(yàn)表明,Hb的催化性能可被Co2+、Cu2+、Pb2+、Fe3+、Zn2+ 激活;EDTA和抗壞血酸可抑制Hb,檸檬酸的酸性環(huán)境利于Hb催化;EDTA、抗壞血酸及檸檬酸均能抑制HRP。
關(guān)? 鍵? 詞:血紅蛋白;辣根過(guò)氧化物酶;流動(dòng)注射光度法;非平衡態(tài);催化活性
中圖分類(lèi)號(hào):TQ426.97? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼: A? ? ? ?文章編號(hào): 1671-0460(2020)11-2467-05
Determination of Dynamic Catalytic Activities of Hemoglobin and
Peroxidase for H2O2/Guaiacol Reaction System by Flow Injection Analysis
DU Pu, LI Yong-sheng
(School of Chemical Engineering, Sichuan University, Chengdu 610065, China)
Abstract: Horseradish peroxidase (HRP) has been widely used in various fields. But it is expensive and hard to preserve, so it will be important to search for an alternative mimetic enzyme. In this paper, taking hemoglobin (Hb) as a mimetic enzyme, dynamic catalytic properties of Hb and HRP to H2O2/guaiacol (GA) reaction under non-equilibrium state were compared by a special flow-injection photometric system (SP-FIA). The results showed that under weak acidity and high temperature environments, Hb was stronger than HRP in the stability; the catalysis of Hb to the H2O2/GA reaction conformed to Michaelis equation, this proved that it could be used as a simulation enzyme. In the study of dynamics, it was found that its catalytic activity to H2O2 and GA was lower than HRP, the affinity of Hb to GA was stronger than that of HRP, and the affinity of Hb to H2O2 was weaker than that of HRP. The interference tests showed that the catalytic activity of Hb could be activated by Co2+, Cu2+, Pb2+, Fe3+ and Zn2+; EDTA and ascorbic acid would lower the catalytic activity of Hb, but the acidity of citric acid was conducive to the Hb catalysis.
Key words: Hemoglobine; Horseradish peroxidase; Flow-injection analysis; Non-equilibrium state; Catalytic activity
過(guò)氧化物酶(peroxidase, POD)存在于真菌、細(xì)菌、陸生生物中[1-2],在有機(jī)合成[3]、污水處理[4]、醫(yī)學(xué)[5]等領(lǐng)域其催化活性被廣泛利用。商用的POD多為辣根過(guò)氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP),但HRP價(jià)格昂貴且不易保存,所以尋找一種來(lái)源豐富、可替代POD的模擬酶就顯得尤為重要。血紅蛋白(Hemoglobine,Hb)是脊椎動(dòng)物紅細(xì)胞內(nèi)的呼吸蛋白,其結(jié)構(gòu)上具有鐵卟啉輔基(血紅素),與HRP結(jié)構(gòu)相似[6],因此有類(lèi)似POD性質(zhì)。HRP只能來(lái)源于辣根,而Hb可從豬、牛等脊椎動(dòng)物血液中提取,其價(jià)格僅為HRP的0.2%,所以Hb是一種很好的POD替代酶。
在用Hb替代POD的研究中,蔡汝秀[7]等首次用其測(cè)定了H2O2和葡萄糖;席永清[8]等也利用Hb催化L-酪氨酸/H2O2反應(yīng)用熒光檢測(cè)器測(cè)定了果蔬中的葡萄糖;王全林[9]等研究了鉻黑-T/Hb/H2O2的顯色反應(yīng)體系;楊濤[10]等利用固體電極伏安法研究了鄰氨基酚/Hb/H2O2反應(yīng)體系行為。但Hb相對(duì)于HRP的催化性能,很少有人報(bào)道。另外,Hb替代HRP的研究多基于手工操作,有人為誤差大、操作繁瑣的不足。
基于流動(dòng)注射光度法(SP-FIA)的準(zhǔn)確度高且重現(xiàn)性好[11-12]的特點(diǎn),將其用于Hb與HRP的催化性能對(duì)比的研究中,以達(dá)到實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠、實(shí)驗(yàn)效率高的目的。本研究首先設(shè)計(jì)了一種新的SP-FIA系統(tǒng),并選擇被廣泛應(yīng)用的愈創(chuàng)木酚? ?(GA)/H2O2反應(yīng)體系作為Hb與HRP的催化對(duì)象,得到的結(jié)果為Hb替代HRP提供了理論根據(jù)。
1? 實(shí)驗(yàn)部分
1.1? 儀器與試劑
使用的試劑主要有GA、H2O2 (30%,質(zhì)量分?jǐn)?shù))、磷酸氫二鈉(Na2HPO3·12H2O)、檸檬酸、濃鹽酸(36%~38%,質(zhì)量分?jǐn)?shù))、EDTA、檸檬酸及抗壞血酸(AsA),均為分析純,購(gòu)于成都科龍化學(xué)試劑公司;Hb和HRP, ≥250 U·mg-1,購(gòu)于Sigma公司;實(shí)驗(yàn)用水為脫氣純水。
使用的儀器主要是FIA-3110流動(dòng)注射裝置、紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)、SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)/水式多用真空泵、KL-UP-IV-20超純水儀、CP224S電子天平、800-1離心機(jī)及pXJ-1C+型離子活度計(jì)。
1.2? 試劑配制
磷酸鹽-檸檬酸緩沖液(pH=5.6):分別稱(chēng)取71.2 g的磷酸氫二鈉和19.2 g的檸檬酸,溶解后分別移入1.0 L容量瓶中,用水定容,得到0.2 mol·L-1的磷酸氫二鈉、0.1 mol·L-1檸檬酸的兩種溶液;然后,取580 mL的磷酸氫二鈉溶液與420 mL的檸檬酸溶液混合。
GA母液(45 mol·L-1):移取446 μL GA于100 mL容量瓶中,用純水定容。
H2O2母液(15 mol·L-1):移取165 μL H2O2? (30%)于100 mL容量瓶中,用純水定容。
HRP溶液(10 kU·L-1):準(zhǔn)確稱(chēng)取0.001 0 g HRP干粉,溶解后移入25 mL 容量瓶中,用純水定容。
Hb溶液(0.6 mol·L-1):稱(chēng)取1.0 g Hb,溶解后轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中,用純水定容。
1.3? 酶活性測(cè)定原理
在過(guò)氧化物酶的催化下,H2O2與GA反應(yīng)生成3,3′-二甲氧基-4,4′-聯(lián)苯二醌(2-GA),該棕色產(chǎn)物在470 nm處有最大吸收[13] (2GA + 2H2O2 + POD → 2-GA + 4H2O)。根據(jù)酶活性定義[14],得到酶活性濃度公式:EPOD = (nV/εvL)(ΔA/Δt);在本研究的SP-FIA系統(tǒng)中n =2,是棕色產(chǎn)物與GA的摩爾比;ε = 0.006 L·(μmol·cm)-1,是2-GA的表觀摩爾吸光系數(shù);L = 1 cm,是流通池光程;ΔA為峰高;Δt為從樣品注入到最高峰出現(xiàn)的留存時(shí)間? ? (0.67 min);V/v = 5.921,是樣品分散度。因此,當(dāng)這些參數(shù)給定時(shí),Ec值僅與ΔA/Δt相關(guān)。
1.4? SP-FIA系統(tǒng)及測(cè)定過(guò)程
SP-FIA流路見(jiàn)圖1,由蠕動(dòng)泵(P)、多功能閥(V)、流通式光度檢測(cè)器和計(jì)算機(jī)組成。其測(cè)定過(guò)程為:當(dāng)多功能閥處于“采樣”位時(shí)兩個(gè)泵同時(shí)運(yùn)行,酶樣和GA/H2O2試劑在P2抽吸下充滿樣品定量環(huán)(SL)和試劑定量環(huán)(RL),多余液體排廢(W),載流磷酸鹽-檸檬酸緩沖液將定量環(huán)中“清洗液塞”推入反應(yīng)盤(pán)管(RC)和流通池,此時(shí)得到空白吸光度值(A0);當(dāng)該閥轉(zhuǎn)到“注入”位,P2停止,P1推動(dòng)注入同一載流中的“酶試樣塞”和“GA/H2O2試劑塞”進(jìn)行追趕滲透,進(jìn)入RC中反應(yīng),生成棕色產(chǎn)物,流通檢測(cè)器給出其吸光度值(A);最后根據(jù)吸光度差(ΔA=A-A0)定量酶活性。
RC—反應(yīng)盤(pán)管; SL—樣品定量環(huán); RL—試劑定量環(huán); CL—清洗劑定量環(huán)。
2? 結(jié)果與討論
2.1? FIA系統(tǒng)的參數(shù)優(yōu)選及其性能的考察
在文獻(xiàn)基礎(chǔ)上[15],用HRP標(biāo)液作為測(cè)試樣品,進(jìn)一步考察了SP-FIA系統(tǒng)流速、樣品及試劑的注入體積、反應(yīng)盤(pán)管長(zhǎng)度對(duì)Hb催化生成的棕色產(chǎn)物吸光度的影響,得到的結(jié)果是:流速為1.91 mL·min-1,樣品注入體積為40 μL,試劑注入體積為150 μL,反應(yīng)盤(pán)管長(zhǎng)度為150 cm,清洗液濃度為0.4 mol·L-1 HCl,注入量為150 μL。
考察了系統(tǒng)的重復(fù)性和線性。在上述優(yōu)選條件下,GA(4.5 mol·L-1)+H2O2(1.5 mmol·L-1)混合液作為試劑,10、30 μmol·L-1 Hb作為測(cè)試樣品,進(jìn)行了11次重復(fù)檢測(cè),得到的RSD小于4%,這證明本系統(tǒng)重現(xiàn)性良好。隨后用一系列Hb標(biāo)液作為測(cè)試樣品考察了系統(tǒng)的線性,結(jié)果表明在? ? ?5~40 μmol·L-1 Hb范圍內(nèi),系統(tǒng)線性響應(yīng)良好(ΔA = 0.019CHb + 0.037 6,R2=0.992),檢出限能達(dá)到? ?0.47 μmol·L-1,可以用該系統(tǒng)對(duì)Hb和HRP進(jìn)行比較研究。
2.2? pH對(duì)Hb和HRP催化活性和穩(wěn)定性的影響
酶蛋白分子側(cè)鏈的解離狀態(tài)受到酸堿環(huán)境影響,會(huì)使酶本身失活或影響與底物的結(jié)合。因此,其他條件不變,磷酸鹽-檸檬酸緩沖液(pH=2.2~8.0)作為系統(tǒng)的載流,考察了Hb和HRP 的最適pH值,到的結(jié)果見(jiàn)圖2。結(jié)果表明,Hb和HRP催化GA/H2O2反應(yīng)形成的棕色產(chǎn)物吸光度均隨pH增加先增大后減小,在pH=4.6時(shí)Hb催化產(chǎn)物吸光度最大(圖2a),pH=6.0時(shí)HRP催化產(chǎn)物吸光度最大(圖2b)。這表明,Hb在偏酸性時(shí)、HRP在中性時(shí)具有較高的催化活性,但兩者在偏堿性環(huán)境中催化活性很低。
繼續(xù)考察了不同酸度環(huán)境下Hb和HRP的穩(wěn)定性。將20 μmol·L-1 Hb及300 U·L-1 HRP標(biāo)液與不同酸度的緩沖液按1∶1混合后,在4 °C下保存24 h,然后作為測(cè)試樣品,注入SP-FIA系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)定,原始混合液的催化活性定為100%,結(jié)果見(jiàn)圖2c。結(jié)果表明,Hb的相對(duì)催化活性在pH=2.2~3.0環(huán)境中約為20%,當(dāng)pH>3.0時(shí)Hb的催化活性隨pH增加而急增,在pH=4.6~5.6時(shí)達(dá)到95%~100%,當(dāng)pH>5.6時(shí)Hb活性急劇下降;對(duì)于HRP,在pH =2.2~3.6時(shí)完全失活,當(dāng)pH >3.6時(shí)HRP活性隨pH增加而增大,當(dāng)pH=5.6~7時(shí)活性穩(wěn)定在95%~100%之間,當(dāng)pH >7時(shí)其活性降低。得到的結(jié)論是:在中性、堿性環(huán)境中HRP穩(wěn)定性強(qiáng)于Hb,在pH=5.6時(shí)Hb及HRP穩(wěn)定性均好。因此,在研究Hb和HRP酶學(xué)性質(zhì)時(shí),緩沖液酸度定為pH=5.6。
2.3? 溫度對(duì)Hb和HRP催化活性和穩(wěn)定性的影響
高溫會(huì)改變酶蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu),從而影響其催化活性。因此,本實(shí)驗(yàn)考察溫度對(duì)Hb和HRP的催化活性的影響。pH=5.6的緩沖液作為載流,其他條件不變,400 U·L-1 HRP及10 μmol·L-1 Hb作為測(cè)試樣品,SP-FIA系統(tǒng)的RC置于恒溫水浴,得到的結(jié)果見(jiàn)圖3a。在25~85 ℃范圍Hb及HRP受溫度的影響趨勢(shì)類(lèi)似,在44 ℃時(shí)催化產(chǎn)物的吸光度最高,所以在動(dòng)態(tài)反應(yīng)下Hb和HRP的最適溫度為44 ℃。
在不同溫度下Hb及HRP保留1 h后,考察了Hb和HRP的熱穩(wěn)定性。將裝有Hb和HRP溶液的試管放在恒溫水浴內(nèi)1 h后,取出冷卻至室溫。未加熱的原始Hb、HRP的催化活性定為100%,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3b。在35~85 ℃范圍Hb的催化活性為95%~100%,當(dāng)超過(guò)85 ℃時(shí)Hb活性開(kāi)始降低;在35~45 ℃范圍,HRP的催化活性約為95%,當(dāng)超過(guò)45 ℃后催化活性迅速下降,95 ℃時(shí)HRP完全失活。因此得出結(jié)論:Hb的溫度耐受性遠(yuǎn)高于HRP,在35~85 ℃下Hb穩(wěn)定性良好;HRP在45 ℃以下穩(wěn)定性較好,高于45 ℃其穩(wěn)定性明顯變差。
2.4? 底物濃度對(duì)Hb和HRP催化活性的影響
利用GA/H2O2/POD反應(yīng)體系定量酶的催化活性時(shí),GA/H2O2濃度會(huì)影響定量Hb或HRP催化性能的響應(yīng)信號(hào),因此首先固定注入的Hb或HRP樣品濃度及H2O2濃度(1.5 mmol·L-1),改變GA/H2O2混合液中的GA濃度(0.1~4.5 mmol·L-1),評(píng)價(jià)了GA濃度的影響。圖4a結(jié)果表明,Hb催化產(chǎn)物的吸光度值隨GA濃度增加而增大,超過(guò)3 mmol·L-1時(shí)產(chǎn)物吸光度趨于穩(wěn)定;HRP的催化產(chǎn)物吸光度在0~3 mmol·L-1GA范圍內(nèi),線性增加,超過(guò)? ? ? ? 4.5 mmol·L-1后產(chǎn)物吸光度不再變化。
GA濃度定為1.5 mmol·L-1,改變GA/H2O2混合液中的H2O2濃度(0~50 mmol·L-1),其他條件如上,評(píng)價(jià)了H2O2濃度的影響。圖4b結(jié)果表明,Hb催化產(chǎn)物的吸光度隨H2O2濃度線性增加而增大,超過(guò)40 mmol·L-1時(shí)產(chǎn)物吸光度不再變化;在? ? 0~1 mmol·L-1 H2O2的范圍內(nèi),HRP的催化產(chǎn)物吸光度線性增加,超過(guò)1.5 mmol·L-1后,產(chǎn)物吸光度不再變化。這說(shuō)明以GA和H2O2為底物時(shí)Hb和HRP催化反應(yīng)均符合Michaelis-Menten動(dòng)力學(xué)規(guī)律。
在此實(shí)驗(yàn)中,進(jìn)一步考察了GA/H2O2/Hb (HRP)反應(yīng)體系相關(guān)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km和vm。在Hb催化下GA 為底物時(shí)得到的 Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)圖見(jiàn)圖4c,由曲線 (y = 2.011 8x + 2.881 8,r =0.993 8)得到KmHb為0.698 mmol·L-1,vmHb為0.347 mmol·(L·min) -1;HRP催化下以GA為底物時(shí)的雙倒數(shù)曲線見(jiàn)圖5c,由曲線(y = 2.071x + 0.282 9,r = 0.996)得到KmHRP為7.37 mmol·L-1,vmHRP為3.56 mmol l·(L·min) -1。由于KmHb < KmHRP,所以Hb對(duì)GA的親和力強(qiáng)于HRP;由于vmHRP > vmHb,所以當(dāng)GA為底物時(shí),Hb的催化活性小于HRP。
在Hb催化下以H2O2為底物時(shí)得到的雙倒數(shù)曲線見(jiàn)圖4d,由曲線(y = 3.682 8x + 0.785 5,r = 0.999)求出以H2O2為底物時(shí)Hb的KmHb為4.68 mmol·L-1,vmHb為1.27 mmol·(L·min) -1。在HRP催化下H2O2為底物時(shí)的雙倒數(shù)曲線見(jiàn)圖4d,由曲線(y =? ?0.960 4 x+0.352 2,r =0.997)求出HRP的KmHRP為2.73 mmol·L-1,vmHRP為2.84 mmol·(L·min)-1。由于KmHb > KmHRP,所以Hb對(duì)H2O2的親和力弱于HRP;vmHb 3? 干擾實(shí)驗(yàn) 在Hb和HRP樣品中分別加入Co2+、Cu2+、Fe3+、Pb2+、Zn2+ (0.1 mmol·L-1),考察了它們的影響。結(jié)果表明,Co2+、Cu2+及Pb2+對(duì)Hb和HRP均有激活作用,對(duì)Hb的激活作用相對(duì)較大;Fe3+和Zn2+對(duì)Hb催化有激活作用,而對(duì)有HRP催化抑制作用,抑制作用由大到小順序?yàn)镕e3+、Zn2+;針對(duì)Hb的激活作用由大到小順序?yàn)閆n2+、Pb2+、Cu2+、Fe3+、 Co2+;針對(duì)HRP的激活作用由大到小順序?yàn)镻b2+、 Cu2+、Co2+。 在Hb和HRP樣品中又添加EDTA (0~0.8 mmol·L-1)、檸檬酸(0~0.2 mmol·L-1)及AsA(0~0.2 mmol·L-1),考察了這3種抑制劑對(duì)Hb和HRP催化活性的影響。結(jié)果表明,這3種物質(zhì)都抑制HRP的催化活性,抑制強(qiáng)度由大到小順序?yàn)闄幟仕?、AsA、EDTA。HRP催化活性降低是由于EDTA及檸檬酸可螯合HRP活性中心Fe2+,AsA可與催化產(chǎn)物反應(yīng),導(dǎo)致計(jì)算結(jié)果呈負(fù)偏差;EDTA和AsA也抑制Hb催化活性,表現(xiàn)為濃度增加,Hb催化活性減小;但在0~0.2 mmol·L-1范圍內(nèi),檸檬酸濃度增加會(huì)使Hb催化活性增強(qiáng),因?yàn)镠b的最適pH為4.6,檸檬酸濃度增大使反應(yīng)體系pH接近了此值,即氫離子對(duì)Hb催化活性的正影響大于檸檬酸螯合造成的負(fù)影響。AsA濃度對(duì)Hb、HRP的催化活性是負(fù)影響,并與催化產(chǎn)物的信號(hào)呈負(fù)的線性相關(guān)(ΔAHb = -0.017CAsA + 0.219,R2=0.999 5;ΔAHRP = -0.456CAsA + 0.214,R2 = 0.991 5)。
4? 結(jié) 論
Hb在弱酸性及高溫環(huán)境下其穩(wěn)定性強(qiáng)于HRP;Hb催化H2O2/GA反應(yīng)體系符合米氏方程,可作為一種過(guò)氧化物模擬酶使用;Hb對(duì)GA的親和力強(qiáng)于HRP,對(duì)H2O2的親和力弱于HRP,Hb對(duì)GA和H2O2催化活性低于HRP。Hb的催化性能可以被Co2+、Cu2+、Pb2+、Fe3+、Zn2+激活;Fe3+、Zn2+對(duì)HRP的酶活性起抑制作用;檸檬酸的酸性環(huán)境利于Hb催化。綜上所述,Hb可作為一種HRP的替代物使用。
參考文獻(xiàn):
[1]PASSARDI F, COSIO C, PENEL C, et al. Peroxidases have more functions than a Swiss army knife[J]. Plant Cell Rep., 2005, 24(5): 255-265.
[2]ALMAGRO L, G?MEZ ROS L V, BELCHI-NAVARRO S, et al. A.Class III peroxidases in plant defence reactions[J]. J. Exp. Bot., 2009, 60(2): 377-390.
[3]WANG S, WANG Q, FAN X, et al. Synthesis and characterization of starch-poly (methyl acrylate) graft copolymers using horseradish peroxidase[J]. Carbohyd. Polym., 2015, 136(9): 1010-1016.
[4]程龍.辣根過(guò)氧化物酶在多壁碳納米管/堇青石復(fù)合載體上的固定化及含油污水處理[D].北京:北京化工大學(xué),2015.
[5]SAA L, GRINYTE R. Blocked enzymatic etching of gold nanorods:application to colorimetric detection of acetylcholine- sterase activity and its inhibitors[J]. ACS Appl. Mater. Inter., 2016,8(17):11139-11146.
[6]ZWART A, BUURSMA A, VAN K E J, et al. Multicomponent analysis of hemoglobin derivatives with reversed-optics spectrophotometer.[J]. Clin. Chem.,1984,30(3):373-379.
[7]黃應(yīng)平,蔡汝秀.血紅蛋白作為過(guò)氧化物模擬酶催化顯色體系的研究與應(yīng)用[J].分析化學(xué),2001,49(4):378-382.
[8]席永清,邱海鷗,楊明,等.血紅蛋白模擬酶催化熒光法測(cè)定葡萄糖[J].分析化學(xué),2008, 36(10):40-45.
[9]王全林,呂功煊.基于血紅蛋白的過(guò)氧化物酶特性測(cè)定其在血漿中游離態(tài)含量[J].分析化學(xué),2003,31(8):945-949.
[10]楊濤,王增健,焦奎,等.血紅蛋白模擬過(guò)氧化物酶催化H2O2氧化鄰氨基酚的固體電極伏安法研究[J].分析試驗(yàn)室,2006, 25(3):1-4.
[11]張吉良.氣體擴(kuò)散—流動(dòng)注射分光光度法測(cè)定水中氟[J]. 沈陽(yáng)化工(當(dāng)代化工), 1994(3):53-55.
[12]趙珍義,馬成龍,陳華. FIA—雙光束分光光度法測(cè)定天然水中微量鐵[J]. 沈陽(yáng)化工(當(dāng)代化工),1992(5):32-34.
[13]HWANG S, LEE C H, AHN I S. Product identification of guaiacol oxidation catalyzed by manganese peroxidase[J]. J. Ind. Eng. Chem. , 2008, 14(4): 487-492.
[14]IUB N C. Nomenclature committee of the international union of bio- chemistry (NC-IUB)-units of enzyme-activity-recommendations 1978 [J]. Eur. J. Biochem. , 1979, 97(2): 319-320.
[15]李永生,鄭巍,高秀峰.基于流動(dòng)注射光度法的吸光度/留存時(shí)間比自動(dòng)測(cè)定過(guò)氧化物酶活性方法[J].分析化學(xué),2015, 43(10):1580-1588.