朱素芹，張語卉，花 辰，李 磊，孫政璽，李 韜

(揚(yáng)州大學(xué)植物功能基因組學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江蘇省作物基因組學(xué)與分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/ 江蘇省作物遺傳生理國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州 225009)

小麥赤霉病是由禾谷鐮刀菌引起的一種真菌性病害，主要發(fā)生在長江中下游麥區(qū)和東北春麥區(qū)[1]，近年來在黃淮冬麥區(qū)也流行成災(zāi)[2-3]。小麥感染赤霉病后不僅嚴(yán)重影響產(chǎn)量[4-5]，而且感病籽粒中積累的毒素嚴(yán)重降低了籽粒品質(zhì)[6-7]。禾谷鐮刀菌產(chǎn)生的毒素主要有兩大類，包括單端孢霉烯族毒素和玉米赤霉烯酮[8]，其中單端孢霉烯族毒素是有毒的倍半萜化合物，包括A、B、C三種類型，其中B型單端孢霉烯族毒素脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)是侵染小麥最重要的致病因子[9]，能夠延緩或終止蛋白的生物合成[10]。DON又稱嘔吐毒素，它和瓜萎鐮菌醇(NIV)及二者的衍生物(3ADON、15ADON和4ANIV)等毒素是世界公認(rèn)的致癌物質(zhì)[11]，會(huì)引起中毒者眩暈、發(fā)燒、惡心、腹瀉等癥狀，嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起出血，影響免疫力和生育力等，直接對人畜健康和生命安全構(gòu)成威脅[12]。近年來市場上面粉廠屢次被檢測出DON含量超標(biāo)，因此嚴(yán)格控制小麥赤霉病的發(fā)生、減少DON的積累才能保證食品安全。我國《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量》規(guī)定，小麥粉、小麥中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇限量標(biāo)準(zhǔn)為1 000 μg·kg-1[13]。目前，還未發(fā)現(xiàn)有效控制 DON 污染的途徑。

維生素E是植物體內(nèi)重要的脂溶性抗氧化劑，包括生育酚和生育三烯酚[14],小麥中的生育酚主要存在于胚中，生育三烯酚存在于果皮和胚乳(含量更高)中[15]。維生素E的生物合成過程主要發(fā)生在葉綠體中[16]，莽草酸途徑和非甲羥戊酸途徑的化合物作為合成的前體，莽草酸途徑的產(chǎn)物尿黑酸(HGA)作為底物生成維生素E親水性頭部，非甲羥戊酸途徑的產(chǎn)物植基二磷酸(PDP)或香葉基香葉基二磷酸(GGDP)分別是形成生育酚和生育三烯酚的前體[17-19]。維生素E不僅是一種抗氧化劑，也是強(qiáng)自由基清除劑[20]，能及時(shí)清除活性氧，防止脂質(zhì)過氧化的發(fā)生[21]。維生素E還可以保護(hù)光合系統(tǒng)中蛋白質(zhì)、色素和多聚不飽和脂肪酸免受氧化損傷[22]。Foyer等[23]推測維生素E可能和其他抗氧化機(jī)制共同發(fā)揮作用來維持細(xì)胞體內(nèi)氧化還原水平的平衡。

王 旭等[24]研究表明，禾谷鐮刀菌侵染小麥籽粒后，導(dǎo)致機(jī)體和細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化和DNA氧化損傷。Rizzo等[25]發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加維生素E能降低DON的毒性作用，從膳食中攝入維生素E能緩解DON引起的急性中毒。但迄今為止，禾谷鐮刀菌在活體和離體培養(yǎng)條件下，維生素E對DON積累是否有調(diào)控作用尚未見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)在活體條件下解析維生素E對小麥赤霉病病小穗率、籽粒毒素含量的效應(yīng)，以及在離體條件下解析維生素E對禾谷鐮刀菌菌絲生長、DON含量和DON合成關(guān)鍵基因Tri5表達(dá)的影響，評價(jià)維生素E對DON積累的效應(yīng)，以期為利用維生素E防控小麥赤霉病菌毒素提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 活體試驗(yàn)材料與方法

1.1.1 小麥材料

試驗(yàn)于2018年10月在揚(yáng)州大學(xué)試驗(yàn)田種植高感小麥赤霉病品種Clark，播種6行，每行15株。

1.1.2 試驗(yàn)所用菌株及其菌液制備

本試驗(yàn)所用菌株為F1312(江蘇省農(nóng)科院陳懷谷研究員提供)。利用滅菌后的接種環(huán)挑取純菌株斜面上的禾谷鐮刀菌邊緣菌體，接種于滅菌的PDA培養(yǎng)基上，于25 ℃恒溫培養(yǎng)5～7 d，用滅菌后直徑7 mm的圓形打孔器取8塊活化的禾谷鐮刀菌菌塊放入80 mL滅菌的綠豆湯培養(yǎng)基中以180 r·min-1、26 ℃搖培72～120 h，吸取1 μL 孢子液，滴到血球計(jì)數(shù)板上，置于顯微鏡下測定孢子濃度，然后稀釋或濃縮到接種需要的濃度(1×105個(gè)· mL-1)。

1.1.3 維生素E溶液的制備

自然情況下，小麥籽粒本體維生素E含量的均值為0.352 μg·g-1[26]。吸取100 μL維生素E溶液(相當(dāng)于1 μg·μL-1)(上海生工生物工程股份有限公司)配制成50 mL的維生素E母液，有機(jī)相微孔濾膜過濾維生素E母液，置于4 ℃冰箱保存。配置三個(gè)濃度梯度的維生素E溶液，分別為本體含量的1倍(3.5×10-4μg·mL-1)、5倍(17.5×10-4μg·mL-1)、10倍(3.5×10-3μg·mL-1)。

1.1.4 禾谷鐮刀菌菌液和維生素E接種及鑒定

采用雙花滴注法(bilateral florets inoculation method， BFI)，在小麥揚(yáng)花期利用醫(yī)學(xué)注射器吸取20 μL制備好的禾谷鐮刀菌菌液，滴注在倒五小穗雙側(cè)小花的內(nèi)外穎之間，同時(shí)在其上下兩側(cè)(倒四、倒六)小穗雙側(cè)小花的內(nèi)外穎之間滴注上述三種濃度的維生素E溶液各20 μL，以只滴注禾谷鐮刀菌菌液為對照(CK)，共4個(gè)處理，每個(gè)處理接種5個(gè)穗子，記載接種日期，接種21 d后鑒定感病小穗數(shù)，病小穗率=感病小穗數(shù)/總小穗數(shù)。

1.1.5 籽粒中DON含量的測定

(1)實(shí)驗(yàn)儀器：三重四級桿液質(zhì)聯(lián)用儀(Thermo Fisher，美國)。

(2)標(biāo)準(zhǔn)液制備：毒素原液DON及三種DON的衍生形態(tài)，即3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(3A-DON)、15-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(15A-DON)和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇-3-葡萄糖苷(D3G)(Fermentek，以色列)，用10%乙腈水配置成100 ppb混標(biāo)溶液。

(3)樣品前處理：樣品的前處理方法參照靳夢瞳等[27]的方法。收獲后小麥穗脫粒，磨樣機(jī)磨碎后，稱取2 g粉碎樣品于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈/水溶液(84/16,v/v)，迅速渦旋振蕩，超聲30 min后，離心5 min，吸取2 mL上清液轉(zhuǎn)至新的10 mL離心管，加入150 mg無水硫酸鎂，渦旋振蕩后吸取上清液轉(zhuǎn)至新的10 mL離心管。再加入1 mL正己烷脫脂后，渦旋離心去除正己烷層，用氮?dú)獯蹈墒Ｓ嗌锨逡海詈笥靡译?水溶液(15/85,v/v)定容至1 mL。渦旋并過0.22 μm尼龍濾膜后，進(jìn)行LC-MS分析。

(4)色譜及質(zhì)譜條件：色譜及質(zhì)譜條件參照靳夢瞳等[27]的方法，略有改進(jìn)。色譜條件：選用ACQUITYUPLCHSST3(2.1×100 mm，1.8 μm)色譜柱，柱溫40 ℃，樣品溫度5 ℃。進(jìn)樣體積為5 μL，流速0.3 mL·min-1。采用流動(dòng)相(A)甲醇和流動(dòng)相(B)醋酸銨組成的流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。洗脫程序：0 min 20%(A)，1.0 min 20%(A)、5.5 min 90%(A)，6.5 min 90%(A)、7.0 min 20%(A)。質(zhì)譜條件：選擇反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)檢測。曲線脫溶劑管(CDL)溫度250 ℃，霧化氣體和干燥氣體均為氮?dú)?，流速分別為3.0、15.0 L·min-1。碰撞氣為高純氬氣，碰撞誘導(dǎo)解離壓力為230 kPa。

1.2 離體試驗(yàn)材料與方法

1.2.1 含有維生素E的PDA和TBI培養(yǎng)基的配制及禾谷鐮刀菌培養(yǎng)

分別在滅菌后的PDA以及TBI培養(yǎng)基[28]中加入小麥本體維生素E含量1倍、5倍、10倍的維生素E溶液，以不添加維生素為對照(CK)，充分混勻并量取20 mL于培養(yǎng)皿中，各處理兩個(gè)重復(fù)，待冷卻凝固后，用滅菌后直徑7 mm的圓形打孔器取一塊活化的禾谷鐮刀菌菌塊于培養(yǎng)皿的中心位置，最后用無菌封口膜封口并置于25 ℃恒溫培養(yǎng)。

1.2.2 禾谷鐮刀菌菌絲生長速率的測定

每隔24 h拍照記錄菌絲生長速度，用游標(biāo)卡尺通過十字交叉法測量禾谷鐮刀菌菌絲的生長直徑，直至菌絲長滿培養(yǎng)皿。

1.2.3 含有維生素E的PDA和TBI培養(yǎng)基中DON含量的測定

用消毒后的刀片將培養(yǎng)基切碎，將培養(yǎng)基：ddH2O按1∶1比例置于錐形瓶中，180 rpm搖培30 min后，用雙層紗布過濾，收集濾液，利用ELISA試劑盒(Beacon Analytical Systems Inc.)進(jìn)行測定，具體過程參照廠家說明書。

1.2.4Tri5基因表達(dá)量的測定

用滅菌后的鑷子挑取禾谷鐮刀菌菌絲于液氮中快速研磨，采用Takara Trizol法提取總RNA，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，用Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)進(jìn)行cDNA的合成。赤霉菌Tri5以及內(nèi)參基因Tublin的引物序列參照王亞君等[29]的方法，實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)具體方法參照產(chǎn)品說明書(TaKaRa,RR047A)。

2 結(jié)果與分析

2.1 活體條件下維生素E對小麥赤霉病病小穗率及籽粒中DON含量的影響

活體條件下，不同濃度的維生素E處理均不能降低高感赤霉病小麥品種Clark的病小穗率(表1)，說明維生素E對小麥赤霉病的擴(kuò)展無 影響。

方差分析表明，接種不同濃度的維生素E后，小麥籽粒中DON含量均與對照呈極顯著差異。多重比較結(jié)果表明，對照籽粒中DON積累量最高，所有維生素E處理下籽粒中DON含量均顯著低于對照，17.5×10-4μg·mL-1維生素E處理下籽粒中DON含量也顯著低于3.5×10-4μg·mL-1的維生素E處理，3.5×10-3μg·mL-1維生素E處理與17.5×10-4μg·mL-1維生素E處理下籽粒中DON含量無顯著差異，表明適量的維生素E能夠顯著減少小麥籽粒中DON的積累(表1)。

2.2 PDA培養(yǎng)基上維生素E對禾谷鐮刀菌菌絲生長和DON積累的影響

與不添加維生素E的對照相比，添加不同濃度維生素E的PDA培養(yǎng)基上禾谷鐮刀菌菌絲的生長速率無明顯差異(圖1)。多重比較結(jié)果表明，不同處理間的禾谷鐮刀菌菌絲在同一時(shí)間點(diǎn)直徑均無顯著差異(表2)，說明在PDA離體條件下，添加不同濃度的維生素E對禾谷鐮刀菌菌絲的生長無顯著影響。

在添加不同濃度維生素E的PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)禾谷鐮刀菌，4 d 后測定培養(yǎng)基中積累的DON含量，方差分析表明，不同處理間的DON含量無顯著差異(P=0.29)，說明在PDA離體培養(yǎng)條件下，添加不同濃度的維生素E對禾谷鐮刀菌中DON含量均無顯著影響。

表1 小麥品種Clark在赤霉菌和不同濃度維生素E接種下的病小穗率及籽粒中的DON含量Table 1 DON content in Clark inoculated with F.g. and vitamin E under different concentrations

1 d、2 d、3 d、4 d為離體培養(yǎng)天數(shù)；VE0、VE1、VE5和VE10分別表示添加維生素E的濃度為0、3.5×10-4、17.5×10-4和3.5×10-3 μg·mL-1。圖2同。

表2 不同維生素E濃度處理下不同時(shí)間點(diǎn)PDA培養(yǎng)基上禾谷鐮刀菌菌絲的直徑Table 2 Hypha growth diameter in PDA medium under different concentrations of vitamin E at different time mm

2.3 TBI培養(yǎng)基上維生素E對禾谷鐮刀菌菌絲生長和DON積累的影響

與不添加維生素E的對照相比，添加不同濃度維生素E的TBI培養(yǎng)基上禾谷鐮刀菌菌絲生長速率無明顯差異(圖2)。多重比較結(jié)果表明，不同處理間的禾谷鐮刀菌菌絲在同一時(shí)間點(diǎn)直徑均無顯著差異(表3)，說明在TBI離體條件下，添加不同濃度的維生素E對禾谷鐮刀菌菌絲生長均無顯著影響。

圖2 不同濃度的維生素E對TBI培養(yǎng)基上禾谷鐮刀菌菌絲生長的影響Fig.2 Effect of vitamin E under different concentrations on the growth of hypha in TBI medium

表3 不同維生素E濃度處理下不同時(shí)間點(diǎn)TBI培養(yǎng)基上禾谷鐮刀菌菌絲的直徑Table 3 Hypha growth diameter in PDA medium under different concentrations of vitamin E at different time mm

在添加不同濃度維生素E的TBI培養(yǎng)基上培養(yǎng)禾谷鐮刀菌，4 d后測定培養(yǎng)基中積累的DON含量。方差分析表明，不同處理間的DON含量無顯著差異(P=0.12)，說明在TBI離體培養(yǎng)條件下，添加不同濃度的維生素E對禾谷鐮刀菌中DON含量均無顯著影響。

2.4 離體條件下維生素E對 Tri5基因表達(dá)量的影響

分別提取在TBI培養(yǎng)基上培養(yǎng)3、4和5 d的禾谷鐮刀菌菌絲RNA，進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)。結(jié)果表明，在培養(yǎng)3、4和5 d時(shí)，添加維生素E培養(yǎng)的菌絲中，Tri5基因的表達(dá)量與對照之間均無顯著差異；但在培養(yǎng)4 d時(shí)，Tri5基因的表達(dá)量在維生素E濃度為3.5×10-4和17.5×10-4μg·mL-1的處理之間有顯著差異(表4)。

表4 添加不同濃度維生素E的TBI培養(yǎng)基培養(yǎng)4 d 時(shí) Tri5基因的表達(dá)量Table 4 Expression level of Tri5 gene at the 4th day in TBI medium with VE

3 討 論

本研究通過活體和離體試驗(yàn)表明，在活體條件下維生素E能顯著減少籽粒中DON含量的積累，并且在一定范圍內(nèi)，隨著維生素E濃度的增加，DON含量逐漸減少，說明在活體條件下維生素E處理負(fù)調(diào)控DON毒素的積累，但不能降低病小穗率，即不能阻止病原菌在穗部的擴(kuò)展，間接說明禾谷鐮刀菌侵染是毒素積累的前提，但病小穗率與毒素積累量沒有必然聯(lián)系。而在離體條件下，不論是在PDA上，還是產(chǎn)毒培養(yǎng)基TBI上，與對照相比，維生素E既不影響菌絲生長，也不能抑制病原菌產(chǎn)毒和下調(diào)Tri5基因的表達(dá)，說明在離體和活體條件下，維生素E對赤霉菌生長的效應(yīng)一致，但在產(chǎn)毒效應(yīng)上有差異，推斷禾谷鐮刀菌本身缺乏對維生素E的應(yīng)答能力，維生素E的抗氧化效應(yīng)沒有被激發(fā)，而活體上維生素E負(fù)調(diào)控毒素的產(chǎn)生，很可能是通過調(diào)控寄主小麥中相關(guān)基因的表達(dá)而間接調(diào)控禾谷鐮刀菌產(chǎn)毒相關(guān)基因的表達(dá)。Atroshi等[30]和Rizzo等[31]的研究表明，維生素E是脂質(zhì)抗氧化劑，它可以保護(hù)DNA免受DON的有害影響，從另一個(gè)角度證明了維生素E對降低DON危害的正面效應(yīng)。小麥在揚(yáng)花和灌漿期容易受到禾谷鐮刀菌的侵染，導(dǎo)致籽粒中會(huì)積累毒素[32]，綜合本研究結(jié)果，認(rèn)為植株上用維生素E處理，可以在一定程度上降低或控制毒素積累，為小麥禾谷鐮刀菌的毒素防控提供新的選擇，對保障食品安全有一定的意義。