范文博，劉 娣

（黑龍江省農業(yè)科學院 畜牧研究所，哈爾濱150086）

冷凍精液保存是人工授精技術最重要的環(huán)節(jié)。研究者對豬冷凍精液保存進行了大量研究，有許多問題制約著這項技術的推廣應用，如質膜完整性差及線粒體活性低等。這些因素會在冷凍過程中顯著降低精子品質。因此，有必要對豬精液冷凍保存的研究現(xiàn)狀、豬精子的冷凍特點與原理、豬精液稀釋液及存在問題進行綜述，為促進豬冷凍精液人工授精技術的生產應用提供理論和實踐基礎。

1 豬精液冷凍保存的研究概況

早期豬冷凍精液技術發(fā)展比較緩慢，存在各種技術的局限，直到1956年英國學者C.Polge進行首次嘗試，將豬冷凍精液用于人工授精，從此推動了冷凍精液技術的發(fā)展。之后其他發(fā)達國家也開始了豬冷凍精液技術的探索。經過大量試驗發(fā)現(xiàn)，豬冷凍精液技術存在很多難題，包括質膜完整性、線粒體活性和DNA完整性在冷凍過程中都會降低，最終會影響精子的品質［1］，這就使得豬人工授精技術的發(fā)展受到局限，也限制了冷凍精液的商業(yè)化生產與應用［2］。

國內對冷凍精液的研究相對緩慢，從1975年開始對豬精液冷凍技術進行研究，但一直沒有突破性進展。1990年開始，研究人員在稀釋液、冷凍保護劑、凍精劑型、解凍液等方面取得了一些成果，但精子損傷、冷凍-解凍機制等多方面尚不完全清楚，仍處于摸索階段［3-4］。在近幾年的研究中發(fā)現(xiàn)，添加抗氧化劑［過氧化物酶、谷胱甘肽、維生素E及植物性抗氧化劑（如紅景天多糖、芝麻酚、黃芩素）］有助于豬精液冷凍保存。但是單單添加這些抗氧化劑還不足以彌補冷凍精液和新鮮精液的差距［5］。目前豬人工授精中使用冷凍精液的比例還很少。

近幾年的研究表明，為提高精液品質，精液冷凍保存研究可以從以下兩方面著手，一是防止冰晶和高滲區(qū)的形成，二是防止氧化損傷。

2 豬精子的冷凍特點與原理

2.1 豬精子的冷凍特點

豬一次射精量大但密度偏低，精子對環(huán)境溫度變化非常敏感，在迅速冷卻時容易失去活力，這種現(xiàn)象在采集精液后溫度迅速冷卻到15，5，0℃時最為嚴重，表現(xiàn)為解凍之后精子活力降低、頂體膜損傷、精子膜的選擇通透性降低等，可以通過改變精子膜上膽固醇和磷脂的比例、烴鏈的飽和程度、蛋白質和磷脂的比例等改善精子抗冷休克的能力。

2.2 豬精子的冷凍原理

豬精子主要是在液氮（-196℃）或干冰（-79℃）中保存。通過設定好步驟控制降溫速度，使精子緩慢降溫，最終將精子放置于液氮或干冰中，降低精子的代謝速率或者使代謝完全終止，得以長期保存［6］。液氮比干冰成本低，應用更為廣泛。隨后經過解凍，精子活率得以恢復，可以進行相關的試驗。在整個冷凍過程中，精子會遭受物理損傷、化學損傷、氧化損傷［7］。物理損傷是指在冷凍過程中細胞內外先后形成的冰晶對精子細胞膜和細胞內部造成的損傷，首先在細胞外形成冰晶，細胞內為正常狀態(tài)，若溫度降低過快則導致細胞內水分不能及時滲出，在細胞內形成冰晶，損傷細胞。冰晶在精子形成過程中是不可避免的，損傷程度也與冰晶形成的大小有一定的關系。為了減少冷凍過程中冰晶對精子的損害，應盡可能使冰晶維持在微晶狀態(tài)，從而提高精子活率?；瘜W損傷是由于細胞外的溶液遇冷先凝結，使得細胞外滲透壓升高，從而使得精子細胞膜內外滲透壓不平衡。若細胞長時間處于這種狀態(tài)會引起精子失水，失水過多會造成精子死亡，從而降低精子活率。滲透壓的改變對精子造成的損傷稱為化學損傷［8］。氧化損傷是在精子冷凍過程中溫度的改變使細胞產生氧化應激反應，產生活性氧?；钚匝跏蔷诱４x產物，處于動態(tài)平衡，并發(fā)揮第二信使的作用，幫助精子細胞內進行正常的生理反應。在冷凍-解凍過程中精子會產生大量活性氧，冷打擊造成氧化脅迫和活性氧的產生，破壞自身的動態(tài)平衡?；钚匝跏沟镁蛹毎ど系牟伙柡椭舅岚l(fā)生氧化反應，從而破壞精子結構的完整性，造成精子死亡，降低精子活率。同時，抗氧化劑的添加使得精子在冷凍過程中適應性增強，需要尋找一種對精子無毒和具有保護作用的抗氧化劑來提高解凍后的精子品質，此方面研究具有重大的研究價值。

3 豬精液稀釋液的研究

現(xiàn)階段豬冷凍精液技術主要包括以下幾個步驟：采集豬精液、鑒定精液品質、精液稀釋液的配制、精液的稀釋方法、精液的冷凍、精液的解凍。豬精液稀釋液的配制是非常重要的環(huán)節(jié)。

3.1 豬精液稀釋液的基本組成

豬精稀釋液是由冷凍保護劑、緩沖液［包括檸檬酸鈉、磷酸鹽、乙二胺四乙酸（EDTA）］、蛋白質、糖類、脂蛋白及添加劑等多種成分組合而成［9］。

冷凍保護劑是在冷凍時保護細胞，避免細胞受到超低溫傷害的化學物質。冷凍保護劑通過減少物理性損傷和增加溶液黏度提高冷凍效果。冷凍保護劑分為滲透性冷凍保護劑和非滲透性冷凍保護劑。滲透性冷凍保護劑是指小分子物質進入細胞內，通過置換細胞內水分調節(jié)滲透壓，主要保護細胞內部。最常用的滲透性冷凍保護劑是甘油，甘油可以減少精子在冷凍、解凍過程中受到的傷害。甘油在溶液中容易結合水分子發(fā)生水合作用，使得溶液的黏性增加，減少了冷凍時水的結晶，從而達到保護精子的作用；但需要注意的是，甘油對精子頂體有嚴重損害，會對精子細胞膜造成傷害［10］。不同動物需要的稀釋液中甘油濃度是不一樣的，現(xiàn)在配制豬冷凍稀釋液時大多使用3%甘油。研究表明，甘油濃度為2%～4%時平衡60 min，冷凍復蘇后精子活力最高［11］。非滲透性冷凍保護劑一般為大分子溶于水的物質，通常無法進入細胞內部，因此又被稱作細胞外冷凍保護劑。目前的研究中，非滲透性保護劑聚蔗糖、蔗糖和海藻糖對豬精液冷凍保存具有良好的效果。

果糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖等糖類都可用于家畜精液的冷凍保存，其中效果最好的是果糖［12］。但在生產中，由于果糖價格較高，使用者只能適當添加，大多使用價格便宜的葡萄糖或蔗糖。在研究豬冷凍精液稀釋液的過程中發(fā)現(xiàn)，糖類的添加不是越多越好，加入2% ～4%葡萄糖精子狀態(tài)最佳；經過反復試驗得出，葡萄糖和乳糖濃度都在2%～3%混合使用效果極佳；將0.05%可溶解性氮-乙酰-D-氨基葡萄糖的稀釋液用于豬冷凍精液，可以明顯提高解凍后精子活力和頂體完整率［13］。

卵黃對精子也有保護作用，卵黃中含有的脂蛋白、卵磷脂類物質可以預防精子發(fā)生冷休克。卵黃中的膽固醇與精子活力有關，有助于精子存活。此外，卵黃可有效減少高滲性的糖和鹽溶液對精子的損傷。稀釋液中卵黃濃度以10% ～20%為宜，加入后應充分混勻。需要特別注意的是，在有氧條件下卵黃中某些氨基酸經酶系統(tǒng)的作用可能產生對精子有害的過氧化氫，因此稀釋液必須現(xiàn)用現(xiàn)配。

眾多試驗結果表明，在豬精液中加入生殖激素、抗生素、細胞因子、咖啡因、生殖激素、氨基多糖、乙酮可可堿等可以使豬精液中的精子存活時間更長，還可以增加精子活力［14］?？寡趸瘎┦秦i精液稀釋液中的重要組成成分，但研究發(fā)現(xiàn)天然無毒的抗氧化劑對凍精品質的提升程度有限。應根據(jù)需要提升的方面不同開發(fā)不同種類的抗氧化劑，這也是目前豬凍精技術的研究熱點之一。

3.2 豬冷凍稀釋液的配制方法

常用的精液稀釋法主要分為兩種，分別是一次稀釋和二次稀釋。一次稀釋法較為簡單，可直接按照相應比例把精液和含甘油的稀釋液均勻混合，再進行冷凍［15］。二次稀釋法則稍繁瑣，先把不含甘油的稀釋液Ⅰ與等體積的精液混勻，經過60～90 min逐漸降溫，使混合液溫度降到5℃；再與稀釋液Ⅱ（即冷凍液，含甘油）進行等體積混合，在5℃條件下靜置5 min，使精液與甘油充分混勻，然后可以進行冷凍。

3.3 常用的冷凍稀釋液配方

目前在精液冷凍-解凍中使用最為廣泛的稀釋液是貝滋維爾溶解液（beltsville thawing solution，BTS），配方為EDTA 0.125 g，檸檬酸三鈉0.6 g，氯化鉀0.075 g，碳酸氫鈉0.125 g，葡萄糖3.7 g，青霉素鈉0.06 g，硫酸鏈霉素0.1 g，純化水100 mL［16］。其中葡萄糖主要用于為精子代謝提供能量，維持正常的生理活動；EDTA是金屬離子螯合劑，避免金屬離子引起精子的過氧化損傷；檸檬酸三鈉具有緩沖作用，維持溶液的酸堿平衡；青霉素鈉和硫酸鏈霉素主要用于抗菌，精子起初沒有細菌，但由于采精時操作不當或者是工具不潔凈都能造成污染；BTS為基礎稀釋液，根據(jù)后加入物質的不同會導致精子各項指標不同。下面介紹二種較好的稀釋液配方。配方1：葡萄糖2 g，乳糖3 g，甘氨酸0.8 g，檸檬酸三鈉0.3 g，青霉素0.03 g，鏈霉素0.05 g，純化水100 mL，20%卵黃，3%甘油［17］。應用此配方后精子活率（33.0±1.2）%，頂體完整率（59.7±2.2）%。配方2：葡萄糖2.5 g，乳糖3.5 g，青霉素0.06 g，鏈霉素0.1 g，純化水80 mL，OEP（一種含有十二烷基硫酸鈉的復合物）0.5 mL，20%卵黃，3%甘油［18］。應用此配方后精子活率（30.22±1.97）%，頂體完整率（39.41±1.60）%。

目前還沒有一種占據(jù)絕對核心地位的豬冷凍精液稀釋液配方，這也是目前豬凍精技術研究的熱點之一。

4 小結

目前對豬精液冷凍技術的研究較多，已取得了一些進展，但要達到應用于實際生產還需要進行更深入的研究?；诒ВúＡЩ├碚摵吞岣呖寡趸芰Φ睦碚撌蔷豪鋬霰４嫜芯康睦碚摶A，即從稀釋液改善和降溫程序調整提高冷凍效果。