班超，秦亞東*，李林華,2

(1. 安徽中醫(yī)藥高等?？茖W校，安徽 蕪湖 241002；2. 安徽中藥資源研究所, 安徽 蕪湖 241317)

瑞香科植物結香(EdegeworthiachrysanthaLindl.)的花蕾、根和莖皮均可入藥[1]。其花蕾為廣西等地區(qū)的民族藥物，是瑤族經(jīng)典老班藥物“五虎、五牛、十八鉆、七十二風”中風類的常用代表藥材，尤其是在瑤族地區(qū)有悠久的藥用歷史，別名夢花、新蒙花等，具有養(yǎng)陰安神，明目，祛障之功[1-3]，因結香花蕾與中藥材密蒙花的性狀以及藥用價值較為相似，常作為密蒙花的替代品[2]。

現(xiàn)代藥理研究證實結香花提取物均有明確的藥理活性，如抗菌作用[4]，抗氧化[5]等作用；化學成分以香豆素和黃酮類化合物為主[6]，如蘆丁、銀椴苷、山奈酚-3-O-吡喃葡萄糖苷等黃酮類化合物[7]。眾所周知，藥用植物中黃酮類化合物具有廣泛而明確的藥理作用，也是中藥材發(fā)揮藥效作用的主要化學類型之一，常作為藥材質(zhì)量控制指標。由于民族藥物開發(fā)研究緩慢，目前針對結香花中的總黃酮含量研究極為罕見，為提高作為藥材的結香花質(zhì)量標準，采用紫外分光光度法建立了安徽不同產(chǎn)地結香花中總黃酮的含量測定方法，本方法測定結果準確、穩(wěn)定、重復性好、簡便可行，為結香花的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Cary60型紫外分光光度計(美國Agilent公司)；DV215CD型十萬分之一精密電子天平(美國Ohaus公司)；FA1204N型JK-250DB型萬分之一精密電子天平(上海民橋精密科學儀器有限公司)；超聲波清洗儀(合肥金尼克機械制造有限公司)；Minispin型臺式離心機(德國Eppendorf公司)。

1.2 材料

結香花采自安徽省內(nèi)六安市、安慶市等地區(qū)，采集時間為2019年1～2月份。新鮮花蕾經(jīng)安徽中藥資源研究所汪榮斌教授鑒定為瑞香科結香屬植物結香 (EdegeworthiachrysanthaLindl.)的花蕾；蘆丁對照品(批號：100080-201907)和D-無水葡萄糖對照品(批號：110833-201809)均購自中國食品藥品檢定研究院；亞硝酸鈉、硝酸鋁、無水乙醇和強氧化鈉等試劑均為市售分析純。

表1 結香花樣品信息表

2 方法與結果

2.1 溶液的配制

2.1.1 蘆丁對照品溶液的配制。精密稱取干燥至恒重的蘆丁對照品0.0160 g，以無水乙醇為溶劑，轉移至100 mL容量瓶中，用無水乙醇定容至刻度，搖勻，即得濃度為0.16 mg/mL蘆丁對照品溶液，置4 ℃冰箱中，備用。

2.1.2 NaOH溶液的配制。準確稱取NaOH固體4.0 g，以蒸餾水溶解后轉移至100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，即得濃度為4%的NaOH溶液。

2.1.3 NaNO2溶液的配制。準確稱取NaNO2固體5.0 g，以蒸餾水溶解后轉移至100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，即得濃度為5%的NaNO2溶液。

2.1.4 硝酸鋁溶液的配制。準確稱取Al(NO3)3·9H2O固體17.6 g，以蒸餾水溶解后轉移至100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，即得濃度為10%的Al(NO3)3溶液。

2.2 結香花供試品溶液的制備

新鮮結香花置于通風處自然晾干后，稱取結香花干燥樣品10.0 g置于圓底燒瓶中，加80%乙醇100 mL回流提取0.5 h，放冷至室溫后濾過，濾渣中繼續(xù)加入150 mL的80%乙醇100 mL再次回流提取0.5 h，放冷至室溫后濾過，合并二次提取的濾液，定容至200 mL容量瓶中，置4 ℃冰箱中，備用。

2.3 總黃酮顯色方法

參考文獻方法[8-9]，對部分條件稍作調(diào)整，具體為：精密量取結香花供試品溶液和蘆丁對照品溶液各1.00 mL分別轉至2個10 mL容量瓶中，加入80%乙醇4.00 mL，搖勻后加入4% NaNO2溶液0.4 mL，搖勻后靜置6 min后，加入10%的Al(NO3)3溶液0.5 mL，搖勻后靜置6 min后，加入4%的NaOH溶液4 mL，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，靜置15 min，即可。以80%乙醇溶液為空白，分別將顯色后的樣品溶液和蘆丁對照品溶液于400～760 nm掃描，結果發(fā)現(xiàn)，最大吸收波長在510 nm附近，故確定測定波長為510 nm。

2.4 方法學考查

2.4.1 線性范圍的考查。分別精密量取蘆丁對照品溶液(0.16 mg/mL)0.20、0.40、0.80、1.20、1.60 mL置于6個10 mL容量瓶中，其余操作按“2.3”項下方法進行，以80%乙醇溶液為空白，于510 nm波長下測定吸光度(A)值，以蘆丁對照品濃度對吸光度A進行線性回歸，線性回歸方程為：A=6.52142×C-0.00021，R2=0.9995，說明蘆丁在0.0032～0.0256 mg/mL濃度范圍內(nèi)與吸光度A呈良好的線性關系。

圖1 蘆丁對照品工作曲線圖

2.4.2 精密度考查。取蘆丁對照品溶液0.40 mL，按“2.3”項下方法進行顯色處理，在510 nm下連續(xù)測定吸光度A值6次，結果相對標準偏差(RSD)為0.57%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復性考查。稱取6份干燥結香花樣品各10.0 g，按“2.2”項下方法提取結香花樣品中總黃酮，按“2.3”項下顯色方法進行顯色，所得6份結香花樣品溶液分別于510 nm下測定吸光度A值，空白溶液為80%乙醇，結果6份樣品吸光度A的RSD為1.43%(n=6)，說明所建立方法重復性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗。稱取干燥結香花樣品10.0 g，按“2.2”項下方法提取結香花樣品中總黃酮，按“2.3”項下顯色方法進行顯色，所得結香花樣品溶液分別于0、0.25、0.5、1、1.5、2 h 測定吸光度A值，結果吸光度A值RSD為0.86%(n=6)，表明結香花供試品溶液在2 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 加樣回收率試驗。精密稱取9份已知總黃酮含量的同一產(chǎn)地來源干燥結香花樣品溶液1.00 g，分布精密加入蘆丁對照品溶液等量，按“2.2”項下方法提取結香花樣品中總黃酮，所加提取溶劑按料液比為1∶10進行，其余操作相同，按“2.3”項下顯色方法進行顯色，以80%的乙醇溶液為空白，于510 nm波長下測定吸光度，代入線性回歸方程計算加樣回收率。結果見表2，總黃酮平均加樣回收率為 96.27%，RSD為0.55%(n=9)，表明該方法測定結果準確可靠。

表2 樣品中總黃酮含量(%)

2.5 樣品含量測定

精密稱取安徽不同產(chǎn)地來源的干燥結香花樣品各約10 g，按“2.2”項下方法提取結香花樣品中總黃酮，其余操作相同，按“2.3”項下顯色方法進行顯色，以80%的乙醇溶液為空白，于510 nm波長下測定吸光度，代入線性回歸方程計算各個產(chǎn)地樣品中總黃酮含量。結果表明，安徽不同產(chǎn)地來源結香花樣品中總黃酮含量在5.07%～8.61%，反映出安徽產(chǎn)結香花樣品總黃酮含量相對均一穩(wěn)定。

3 討論

3.1 提取條件的優(yōu)化，預試驗中對提取溶劑、提取方式等進行了單因素考查。對水、甲醇、乙醇3種常用提取溶劑進行了考查，考慮到水為提取溶劑時提取溫度較高，容易導致黃酮類化合物發(fā)生氧化等反應，而甲醇毒性較大，因此選擇乙醇為提取溶劑，分別設計40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇和無水乙醇為溶劑進行單因素試驗考查，結果發(fā)現(xiàn)80%乙醇為提取溶劑時總黃酮含量較高，因此，本試驗選擇以80%乙醇為結香花樣品總黃酮提取溶劑；同時對回流提取、超聲提取、滲漉提取方式進行了單因素考查，結果發(fā)現(xiàn)超聲提取效率較低，可能是由于干燥結香花樣品溶劑難以浸潤有關，滲漉提取率較高，但耗費時間明顯長于回流提取法，因此，本試驗選擇回流提取方式，提取2次后，繼續(xù)回流提取，總黃酮含量未見明顯升高，因此提取次數(shù)確定為2次；料液比也進行了單因素考查，料液比為1∶10時可以充分提取結香花中的總黃酮，繼續(xù)提高料液比對總黃酮提取沒有顯著區(qū)別。

3.2 本試驗參考相關文獻報道，建立了安徽產(chǎn)結香花中總黃酮的含量測定方法，試驗結果表明，該方法測定結果準確可靠、精密度和重復性良好、回收率高，操作簡便易行，適用于安徽產(chǎn)結香花中總黃酮的含量測定。結果顯示收集于安徽8個產(chǎn)地的結香花樣品中總黃酮的含量介于5.07%～8.61%，表明安徽產(chǎn)結香花中總黃酮含量較為穩(wěn)定，可用于安徽產(chǎn)結香花藥材的質(zhì)量控制。