王喻淇，劉子菡，王少平，王鵬飛，董凡，代龍，張加余*

1.濱州醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264000；2.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 102488；3.山西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，山西 晉中 030600

高尿酸血癥(hyperuricemia，HUA)是指由體內(nèi)嘌呤核苷酸代謝紊亂和(或)尿酸(uric acid，UA)排泄障礙引起血尿酸水平升高的代謝性疾病[1-2]。目前，臨床上治療HUA一般使用別嘌醇片、非布司他、苯溴馬隆等藥物，通過抑制黃嘌呤氧化酶的活性或促進(jìn)UA排泄從而發(fā)揮降UA的作用。但是，這些藥物在調(diào)控UA水平的同時(shí)會(huì)對(duì)其他內(nèi)源性代謝過程產(chǎn)生不良影響。如苯溴馬隆可導(dǎo)致慢性肝損傷等[3-5]，限制了其臨床應(yīng)用。目前依然缺乏可以治療HUA的安全有效藥物，因此尋找新的HUA治療藥物具有重要意義。

雙向發(fā)酵技術(shù)是將藥用真菌與中藥材有機(jī)結(jié)合的復(fù)合型中藥生產(chǎn)工藝。中藥經(jīng)發(fā)酵后可起到減毒(槐耳/烏頭菌質(zhì))、增效(槐耳/黃芪菌質(zhì))、擴(kuò)效(槐耳/板藍(lán)根菌質(zhì))等作用[6-9]。黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge.var.mongholicus(Bge.) Hsiao是常用的大宗中藥品種，具有補(bǔ)氣升陽、固表止汗、利水消腫等功效[10]。蟬花，亦即蟬擬青霉Paecilomycescicadae，是麥角菌科真菌大蟬草CordycepscicadaeShing寄生于蟬科昆蟲山蟬CicadafiammataDist.若蟲上的子座及若蟲尸體的復(fù)合體，是一種具有悠久藥用歷史的名貴真菌，具有很強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤活性[11-12]。鑒于臨床常以補(bǔ)腎健脾、清熱利濕及活血化瘀類中藥治療HUA，本研究取黃芪和蟬擬青霉配伍組合的補(bǔ)脾益腎之功，利用雙向發(fā)酵技術(shù)優(yōu)化制備蟬擬青霉/黃芪雙向發(fā)酵菌質(zhì)，闡明菌質(zhì)中有效成分含量的變化，并采用氧嗪酸鉀鹽誘導(dǎo)大鼠HUA模型，初步評(píng)價(jià)雙向發(fā)酵菌質(zhì)的抗HUA作用，以期優(yōu)化黃芪藥效并為臨床治療HUA的新藥研發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠，雄性，體質(zhì)量220～250 g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006。

1.2 試藥

蟬擬青霉(編號(hào)：cfcc81169)由中國林業(yè)微生物保藏中心提供；黃芪藥材購于北京本草方源藥業(yè)集團(tuán)有限公司，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)張媛副教授鑒定為蒙古黃芪A.membranaceus(Fisch.) Bge.var.mongholicus(Bge.) Hsiao的干燥根；氧嗪酸鉀鹽購自美國Sigma公司；苯溴馬隆片(Narcarin)購自德國Excella GmbH公司，批號(hào)：1707134；對(duì)照品蘆丁(批號(hào)：17122001，純度≥98.0%)購于成都曼思特生物科技有限公司；對(duì)照品無水葡萄糖(批號(hào)：140648-201804，純度≥98.0%)購自中國食品藥品檢定研究院；定標(biāo)液、質(zhì)控液和檢測試劑盒購于北京利德曼生化技術(shù)有限公司產(chǎn)品；總膽固醇(total cholesterol，TC)測定試劑盒(批號(hào)：00110)、三酰甘油(triglyceride，TG)測定試劑盒(批號(hào)：112293K)、UA測定試劑盒(批號(hào)：00275)、尿素氮(urea nitrogen，BUN)測定試劑盒(批號(hào)：01049)、肌酐(creatinine，CRE)測定試劑盒(批號(hào)：04210)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)試劑盒(批號(hào)：00612)和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)試劑盒(批號(hào)：01192)購于北京利德曼生化技術(shù)有限公司。

1.3 儀器

CX-4 Pro型全自動(dòng)生化分析儀(美國Beckman公司)；R200D型十萬分之一電子分析天平(德國Sartorius公司)；Millipore Synergy UV型超純水機(jī)(美國Millipore公司)；BXM-30R 型高壓蒸汽滅菌鍋(西安儀創(chuàng)實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備有限公司)；UV-2000型紫外可見分光光度計(jì)(北京瑞利分析儀器公司)；FW-100型高速粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)；LHS-80HC-Ⅱ型恒溫恒濕培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)。

2 方法

2.1 蟬擬青霉/黃芪雙向發(fā)酵菌質(zhì)的制備

2.1.1菌種活化與液體培養(yǎng) 將蟬擬青霉接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)斜面培養(yǎng)基上，置于27 ℃、相對(duì)濕度80%的恒溫恒濕箱活化培養(yǎng)5 d，備用。用接種環(huán)挑取活化后的蟬擬青霉置于馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中，25 ℃、140 r·min-1的搖床條件下培養(yǎng)7 d備用。

2.1.2雙向發(fā)酵菌質(zhì)的制備 黃芪藥材粉碎后過100目篩。取粉末50 g置于500 mL錐形瓶，加入蒸餾水至250 g混合攪拌均勻，向混合液中添加0.3%纖維素酶和0.3%果膠酶，于50 ℃下酶解90 min，放入121 ℃高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌30 min，得黃芪提取液；將黃芪提取液冷卻至室溫，接種10 mL蟬擬青霉種子液，在28 ℃、120 r·min-1的搖床條件下培養(yǎng)7 d，即得蟬擬青霉/黃芪雙向發(fā)酵菌質(zhì)。

2.1.3黃芪提取液、雙向發(fā)酵菌質(zhì)中化學(xué)成分含量測定 取黃芪提取液、雙向發(fā)酵菌質(zhì)各10 mL，離心后吸取上清液，加入無水乙醇反復(fù)傾倒數(shù)次，靜置過夜后再次離心，沉淀加入80%無水乙醇混勻，靜置10 min，5500 r·min-1離心5 min(離心半徑10 cm)，棄去上清液，沉淀加水加熱溶解后定容，采用蒽酮-硫酸比色法[13]測定樣品粗多糖和總糖的含量。取黃芪提取液、雙向發(fā)酵菌質(zhì)各10 mL，離心后吸取上清液，采用乙酸乙酯反復(fù)萃取，得黃芪提取液、黃芪菌質(zhì)中的總黃酮，并利用NaNO2-A1(NO3)3比色法[14]測定總黃酮含量。采用酸堿滴定法測定黃芪提取液、雙向發(fā)酵菌質(zhì)中的總酸。每份樣品平行測定3次，取平均值。

2.2 模型制備及給藥

56只SD大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為對(duì)照組、HUA模型組、苯溴馬隆組、黃芪雙向發(fā)酵菌質(zhì)(以下簡稱“菌質(zhì)”)低劑量組、菌質(zhì)高劑量組、黃芪低劑量組和黃芪高劑量組，每組8只。動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。各組均給予正常飼料喂養(yǎng)，對(duì)照組灌胃給予蒸餾水；其余各組每天灌胃氧嗪酸鉀鹽300 mg·kg-1造模。造模后1 h，陽性對(duì)照組灌胃苯溴馬隆20 mg·kg-1，菌質(zhì)低劑量組和高劑量組分別灌胃給予150、300 mg·kg-1(以黃芪生藥量計(jì))雙向發(fā)酵菌質(zhì)，黃芪低劑量組和高劑量組分別灌胃給予150、300 mg·kg-1(以黃芪生藥量計(jì))黃芪提取液；連續(xù)給藥14 d，每天2次，灌胃量均為15 mL·kg-1。

2.3 血清樣品的收集

最后一次給藥后4 h，大鼠進(jìn)行眼眶靜脈叢取血。血樣于4 ℃靜置過夜，離心取血清，用于生化指標(biāo)的測定。

2.4 生化指標(biāo)測定

采用全自動(dòng)生化分析儀在常規(guī)定標(biāo)、質(zhì)量控制后，檢測血清中UA、TC、TG、CRE、BUN、ALT及AST水平。

2.5 數(shù)據(jù)分析

3 結(jié)果與討論

3.1 菌質(zhì)中成分的含量變化

采用無水葡萄糖為對(duì)照品，在620 nm處測定吸光度(A)值，以A值(Y)對(duì)濃度進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y=0.011 9X+0.002 5(r=0.998 5)。結(jié)果表明，與黃芪提取液比較，雙向發(fā)酵菌質(zhì)的總多糖含量明顯增加，為黃芪提取液的1.37倍。采用蘆丁為對(duì)照品，在510 nm處測定A值，以A值對(duì)濃度進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y=13.839X+0.029 7(r=0.999 8)。結(jié)果表明，與黃芪提取液比較，雙向發(fā)酵菌質(zhì)總黃酮的含量明顯下降，僅為黃芪提取液的1/3。采用酸堿滴定法，用已知濃度的NaOH溶液滴定黃芪提取液及雙向發(fā)酵菌質(zhì)溶液，結(jié)果表明總酸的含量變化并不明顯(見表1)。

表1 黃芪經(jīng)發(fā)酵后成分含量變化 mg·mL-1

3.2 菌質(zhì)對(duì)HUA大鼠血清UA水平的影響

如圖1所示，與對(duì)照組比較，氧嗪酸鉀鹽誘導(dǎo)的HUA模型組大鼠血清UA水平顯著升高(P<0.001)，提示模型制備成功。與模型組比較，陽性藥苯溴馬隆組，菌質(zhì)低、高劑量組及黃芪低、高劑量組均顯著降低了大鼠血清UA水平(P<0.001)。其中，菌質(zhì)組與黃芪組降UA的作用效果均優(yōu)于苯溴馬隆組，菌質(zhì)高劑量組的作用效果最強(qiáng)，優(yōu)于黃芪高劑量組(P<0.05)，菌質(zhì)低劑量組與黃芪低劑量組效果無明顯差異。

注：與對(duì)照組比較，***P<0.001；與模型組比較，+++P<0.001；與菌質(zhì)高劑量組比較，#P<0.05。圖1 各組大鼠血清UA水平

3.3 菌質(zhì)對(duì)HUA大鼠血脂指標(biāo)的影響

如圖2所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清TC和TG水平顯著升高(P<0.05，P<0.001)。與模型組比較，苯溴馬隆僅能降低血清TG水平(P<0.01)；菌質(zhì)低、高劑量組及黃芪低、高劑量均能顯著降低模型大鼠血清TC和TG水平(P<0.05，P<0.01)。同時(shí)，隨著劑量在一定范圍內(nèi)的增加，菌質(zhì)組及黃芪組的調(diào)脂作用也隨之增強(qiáng)。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，***P<0.001；與模型組比較，+P<0.05，++P<0.01。圖2 各組大鼠血脂指標(biāo)

3.4 菌質(zhì)對(duì)HUA大鼠腎功能指標(biāo)的影響

如圖3所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清BUN水平顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，菌質(zhì)低、高劑量及黃芪高劑量均能夠顯著降低模型大鼠血清BUN水平(P<0.05，P<0.01，P<0.001)；苯溴馬隆對(duì)血清BUN水平無明顯影響。此外，各組大鼠CRE水平無明顯差異。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，+P<0.05，++P<0.01，+++P<0.001。圖3 各組大鼠血清腎功能指標(biāo)

3.5 菌質(zhì)對(duì)HUA大鼠肝功能指標(biāo)的影響

如圖4所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清ALT和AST水平顯著升高(P<0.05，P<0.001)。與模型組比較，菌質(zhì)高劑量組及黃芪高劑量組均能夠明顯降低大鼠血清ALT和AST水平(P<0.05，P<0.01，P<0.001)，且菌質(zhì)高劑量組藥效作用最強(qiáng)，明顯優(yōu)于黃芪高劑量組(P<0.05)。而苯溴馬隆組大鼠血清ALT和AST水平均明顯升高，ALT水平甚至高于模型組。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，***P<0.001；與模型組比較，+P<0.05，++P<0.01，+++P<0.001；與菌質(zhì)高劑量組比較，#P<0.05。圖4 各組大鼠血清肝功能指標(biāo)

4 討論

黃芪可用于治療脾肺氣虛、氣虛自汗、氣血虧虛及氣虛血腫癥。取其健脾之功，可助脾氣升清，運(yùn)化輸布水谷精微，使水氣輸布得當(dāng)，減少體內(nèi)水液停聚，從而降低體內(nèi)UA水平。以“高尿酸血癥”和“治療”為關(guān)鍵詞，選取中醫(yī)學(xué)、中藥學(xué)、中西醫(yī)結(jié)合條件進(jìn)行CNKI檢索，并對(duì)包含中藥治療的文獻(xiàn)進(jìn)行藥味統(tǒng)計(jì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃芪用藥頻次為67次，用藥頻率為26.8%，位居第7位[15]。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，HUA所引起的并發(fā)癥痛風(fēng)發(fā)病日久，傷及肝脾腎，多用健脾柔肝、補(bǔ)腎固本之品。臨床上常取黃芪益氣補(bǔ)脾、健脾利濕之功，用于HUA的干預(yù)治療?，F(xiàn)代研究表明，黃芪具有胰島素增敏作用且明顯改善胰島素抵抗對(duì)UA的影響[16]。此外，以黃芪為主要藥味的黃芪四妙散[17]、黃芪桂枝五物湯[18]等方劑對(duì)HUA具有較好的療效。同樣，蟬花也具有降低血、尿CRE水平，提高內(nèi)生CRE清除率，改善血清蛋白含量，減少尿蛋白的排出等功效，具有一定的降UA作用[19]，在以蟬花為君藥的蟬花湯延緩慢性腎功能衰竭進(jìn)展的臨床研究中也發(fā)現(xiàn)類似功效[20]?；诖?，本研究以蟬擬青霉作為發(fā)酵菌株，黃芪作為藥性基質(zhì)，采用新型雙向液體發(fā)酵技術(shù)，在一定的優(yōu)化條件下制備所得的發(fā)酵菌質(zhì)具有顯著的抗HUA活性，為UA治療的新藥研發(fā)工作提供了新的思路。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，菌質(zhì)中各活性物質(zhì)水平明顯變化，主要包括多糖類和黃酮類物質(zhì)。幾種活性成分總量分析結(jié)果表明，發(fā)酵處理后的菌質(zhì)中總多糖水平上升，說明蟬擬青霉不斷代謝產(chǎn)生的纖維素酶類物質(zhì)可破壞黃芪藥材的細(xì)胞壁，分解細(xì)胞壁中的纖維素、木質(zhì)素等物質(zhì)，促進(jìn)黃芪多糖的溶出[21]；同時(shí)，黃芪也促進(jìn)了蟬擬青霉的生長、分裂和發(fā)育，促進(jìn)其胞外多糖的分泌，從而提高了菌質(zhì)中多糖的水平。同時(shí)，發(fā)酵處理后的菌質(zhì)總黃酮含量下降，其可能的原因是在發(fā)酵過程中，蟬擬青霉不僅能合成黃酮類化合物同時(shí)還可分解黃酮類化合物，但其分解的速度大于合成的速度，因此導(dǎo)致總黃酮水平下降。

本課題組前期采用UHPLC-LTQ-Orbitrap對(duì)比分析了黃芪雙向發(fā)酵前后的化學(xué)成分，結(jié)合色譜保留行為、相對(duì)分子質(zhì)量、碎片離子及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，共分析鑒定了107個(gè)化學(xué)成分，其中包括42個(gè)皂苷和65個(gè)黃酮類成分。發(fā)酵前后皂苷類成分由42個(gè)降至29個(gè)，部分皂苷(乙?；蜷L鏈皂苷，如異黃芪皂苷Ⅰ、異黃芪皂苷Ⅱ)的含量大幅減少，次生苷或苷元類成分的含量上升明顯；黃酮類成分則由47個(gè)上升到52個(gè)，部分黃酮苷(如毛蕊異黃酮苷和染料木苷)的含量大幅下降。這表明，苷類在發(fā)酵過程中易被代謝成次生苷或苷元，導(dǎo)致極性減小，脂溶性增加，從而提高了其在人體的生物利用度，利于其藥效的發(fā)揮[22]，與已知文獻(xiàn)報(bào)道相一致[23]，充分體現(xiàn)了中藥發(fā)酵可以使其活性成分較大限度釋放的優(yōu)點(diǎn)。

HUA在我國的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，是代謝紊亂的重要標(biāo)志。臨床研究發(fā)現(xiàn)，約82%的HUA患者并發(fā)高甘油三酯血癥，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢[24]；在健康人群中血清UA水平與TG水平也呈正相關(guān)[25]。本實(shí)驗(yàn)采用灌胃氧嗪酸鉀鹽誘導(dǎo)HUA模型，造模簡單有效。連續(xù)灌胃氧嗪酸鉀鹽2周后，模型組大鼠血清中UA、BUN、ALT、AST、TC及TG水平均顯著高于對(duì)照組，說明氧嗪酸鉀鹽誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生了HUA模型，并伴隨著高甘油三酯癥和肝腎功能損傷。

血清UA水平是HUA重要的臨床指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)灌胃給予黃芪提取液及蟬擬青霉/黃芪雙向發(fā)酵菌質(zhì)150、300 mg·kg-1能顯著降低模型大鼠血清UA水平，且菌質(zhì)高劑量降UA作用顯著高于黃芪高劑量，兩者作用效果均強(qiáng)于陽性藥苯溴馬隆。同時(shí)，菌質(zhì)組和黃芪組大鼠血清TC和TG水平顯著降低，減少了高甘油三酯癥患病風(fēng)險(xiǎn)。

血清中的ALT、AST、BUN及CRE水平為衡量肝腎功能的重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)中，大鼠連續(xù)灌胃氧嗪酸鉀后，與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中ALT、AST、BUN及CRE水平均顯著升高，說明氧嗪酸鉀鹽誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生了肝腎損傷。研究結(jié)果表明，苯溴馬隆雖能夠降低氧嗪酸鉀誘導(dǎo)的大鼠血清UA水平，但對(duì)ALT、AST、BUN及CRE水平無影響。而黃芪高劑量及菌質(zhì)高劑量能夠顯著降低血清ALT、AST及BUN水平，且菌質(zhì)組作用效果明顯優(yōu)于黃芪組，尤其是血清AST水平。

基于上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，黃芪經(jīng)蟬擬青霉發(fā)酵后所得蟬擬青霉/黃芪雙向發(fā)酵菌質(zhì)對(duì)氧嗪酸鉀誘導(dǎo)的HUA模型大鼠血清UA水平具有顯著的降低作用，對(duì)模型大鼠血脂水平及肝腎功能具有一定的干預(yù)作用，且作用效果優(yōu)于黃芪單藥。本研究為開發(fā)抗HUA中藥新藥、減少HUA并發(fā)癥、整體改善機(jī)體代謝紊亂狀態(tài)提供了依據(jù)。