王亞楠，閆明，2，汪祺*，文海若*

1.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050；2.中國藥科大學，江蘇 南京 210009

雷公藤甲素(triptolide，TPL)來源于雷公藤的根，是其主要活性成分之一，研究表明雷公藤具有抗炎、抗風濕、抗癌等廣泛的生物活性[1-4]。隨著雷公藤甲素應用的增多，大量研究報道表明，雷公藤甲素具有生殖功能毒性、腎毒性、肝毒性等[5-7]，另外，其對人體潛在的遺傳毒性也成為研究關(guān)注的重點。本課題組采用歐盟開發(fā)的基于決策樹的毒性預測平臺Toxtree軟件(Version 3.1.01851，Istituto Superiore di Sanita，Italy)預測顯示其存在遺傳毒性致癌性、鼠傷寒沙門氏菌結(jié)構(gòu)預警及嚙齒類動物體內(nèi)微核結(jié)構(gòu)預警。然而，其遺傳毒性產(chǎn)生的具體影響尚缺乏相關(guān)研究，僅有部分研究提出，TPL可能導致染色體損傷，如曹易懿[8]研究指出TPL(0.5～75 nmol·L-1)可以誘導人成淋巴TK6細胞微核率升高，楊建一等[9]發(fā)現(xiàn)雷公藤多苷10～30 mg·kg-1能夠引起小鼠骨髓細胞微核率和染色體畸變率升高?；蛲蛔兪前┌Y發(fā)生與發(fā)展的重要原因，也是遺傳毒性評價的重要檢測終點之一，當前TPL致基因突變風險評價方面的研究較少。

Pig-a基因位于X染色體，編碼形成糖磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol，GPI)錨定生物合成所需的N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶的催化亞基，其片段中單一突變即可影響GPI錨的合成，并導致細胞表面GPI錨鏈蛋白的缺失(如CD59、CD24、CD90等)，從而可通過檢測細胞膜表面錨鏈蛋白表達水平評價受試物的潛在致基因突變風險。近年來基于Pig-a基因的體外研究也獲得一定進展，有相關(guān)研究使用小鼠淋巴瘤L5178Y細胞建立體外Pig-a基因突變模型并已對該方法進行了驗證研究[10-12]。本實驗室首次在國內(nèi)成功建立并驗證基于L5178Y細胞的體外Pig-a基因突變模型[13]。本研究使用L5178Y細胞和昆明種(KM)小鼠分別開展體外和體內(nèi)Pig-a基因突變研究，評價TPL的潛在致基因突變風險。

1 材料

1.1 細胞

L5178Y TK+/-(3.7.2C)細胞來自日本國立醫(yī)藥品食品衛(wèi)生研究所，經(jīng)支原體檢查后于液氮長期保存。研究所用細胞為復蘇傳代后10代以內(nèi)。

1.2 實驗動物

SPF級雄性KM小鼠25只，5～6周齡，體質(zhì)量25～30 g，購自中國食品藥品檢定研究院，實驗動物許可證號：SCXK(京)2017-0005)；在恒溫(20～26 ℃)、恒濕(40%～70%)、各12 h明暗周期的條件下飼養(yǎng)。飼養(yǎng)密度為每籠2～3只；提供經(jīng)鈷60放射滅菌的鼠全價顆粒飼料，自由攝食及飲水，取材前不禁食禁水。

1.3 試藥

TPL(中國食品藥品檢定研究院，批號：111567-201404，純度：99.8%)；二甲基亞砜(DMSO，批號：#BCBW5664)、6-磷酸葡萄糖(批號：WXBC7942V)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二鈉(批號：18E2156560)、青鏈霉素混合液(批號：2019313)、N-乙基-N-亞硝基脲 (N-nitroso-N-ethylure，ENU，批號：MKCD2123，純度：98%)、甲基磺酸乙酯(ethylmethylsulfone，EMS，批號：126K0758，純度：98%)、苯并芘[benzoapyrene，B(a)P，批號：SLBF45532，純度：96%)均購于Sigma-Aldrich公司；馬血清(批號：AC10235369)、磷酸鹽緩沖液(PBS，批號：AD19942268)，Hyclone公司；APC標記CD45抗體(批號：7166674)、PE標記CD90.2抗體(批號：7110569)、PE標記CD24抗體(批號：553262)、PE標記CD61抗體(批號：553347)均購自BD Biosciences公司；抗-PE磁珠(批號：51810917330)、LS柱(批號：5180614049)均購自Miltenyi公司；哺乳動物淋巴細胞分離液(批號：55-182，Cedarlane公司)、SYTO?13 綠色熒光核酸染料(批號：1987320)、RPMI 1640培養(yǎng)基(批號：2025394)、胎牛血清(FBS，批號：1908121)、絕對計數(shù)磁珠(批號：C3695)均購自Thermo Fisher公司；肝勻漿S9(批號：20181105，北京安保迪科技有限公司)。

1.4 儀器

FACSCalibur流式細胞儀(BD bioscience公司)；Centrifuge 5810R型高速冷凍離心機(Eppendorf公司)；HERA cell VIOS 160i型二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Fisher公司)；NU-543-400S型生物安全柜(Nuair公司)；CKX31型倒置顯微鏡(Nikon公司)；QuadroMACSTMSeparator免疫磁性分離架(Miltenyi公司)。

2 方法

2.1 基于L5178Y細胞的體外Pig-a基因突變實驗

2.1.1細胞培養(yǎng) 將L5178Y細胞解凍復蘇后置于完全培養(yǎng)基R10(含10%馬血清、1%青-鏈霉素混合液、丙酮酸鈉0.2 mg·mL-1的RPMI 1640培養(yǎng)基)，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)基隔天更換，待細胞增殖至適宜密度后進行實驗。

2.1.2TPL對L5178Y細胞的毒性檢測 非S9(-S9)代謝條件：細胞達對數(shù)生長期后，更換R0培養(yǎng)基(含1%青-鏈霉素混合液和丙酮酸鈉0.2 mg·mL-1的RPMI 1640培養(yǎng)基)，分為對照組(DMSO)、陽性對照組(EMS 500 μg·mL-1)和TPL不同質(zhì)量濃度(6.3、12.5、25、50、100 ng·mL-1)組，各組加入不同藥物后，調(diào)整細胞密度為50×104個/mL于10 mL培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2條件下與受試物作用24 h。收集細胞并計數(shù)，室溫離心(340×g，5 min)，PBS洗滌2次。將細胞重懸于10 mL完全培養(yǎng)基R10并維持密度為1.0×106～2.0×106個/mL，培養(yǎng)8 d。

S9(+S9)代謝條件：細胞達對數(shù)生長期后，更換R0培養(yǎng)基，分為對照組(DMSO)、陽性對照組[B(a)P 5.0 μg·mL-1]和TPL不同質(zhì)量濃度(12.5、25、50、100、200 ng·mL-1)組，各組加入不同藥物和2% S9后，調(diào)整細胞密度為50×104個/mL于50 mL離心管中，置于氣浴搖床中37 ℃、20 r·min-1振搖4 h。細胞經(jīng)室溫離心(340×g，5 min)后，PBS洗滌2次。將細胞重懸于10 mL完全培養(yǎng)基R10。給藥后24 h細胞計數(shù)，將細胞密度維持為1.0×106～2.0×106個/mL，培養(yǎng)8 d。

細胞毒性通過細胞倍增速率(PD)和相對細胞倍增速率(RPD)進行評價，見公式(1)～(2)。

PD=lg(受試物處理后細胞數(shù)/初始細胞數(shù))/lg2

(1)

RPD=(PD藥物/PD對照)×100%

(2)

2.1.3TPL對L5178Y細胞Pig-a基因突變率的影響 細胞分組及處理同2.1.2項下。取2×106個細胞進行離心(340×g，4 ℃，5 min)，棄上清，每組加5 mL工作液(含有2%FBS的PBS)，混勻離心(340×g，4 ℃，5 min)。吸棄上清液，每孔加入CD45、CD90.2抗體混合工作液200 μL，終質(zhì)量濃度為1 μg·mL-1，重懸細胞并混合均勻。將細胞置于2～8 ℃避光孵育30 min，后置于室溫繼續(xù)孵育10 min。孵育結(jié)束后，重懸細胞后轉(zhuǎn)移至5 mL工作液中離心(340×g，4 ℃，3 min)。吸棄上清液，加入300 μL工作液，混合均勻后轉(zhuǎn)入流式管中上機檢測。突變型細胞表面無CD90.2蛋白，CD45蛋白正常表達，故在流式圖中顯示無藻紅蛋白(PE)熒光，別藻藍蛋白(APC)熒光正常，根據(jù)公式(3)計算細胞相對突變數(shù)。

細胞相對突變數(shù)=突變細胞數(shù)/總細胞數(shù)×106

(3)

2.2 KM小鼠體內(nèi)Pig-a基因突變實驗

2.2.1分組與給藥 KM小鼠在給藥前檢疫適應6 d。根據(jù)文獻及課題組前期研究確定最終實驗用TPL劑量為50、100、200 μg·kg-1[14-15]。檢疫期第6天按體質(zhì)量隨機分組法分為5組(對照組、雷公藤甲素各劑量組、陽性對照ENU組)，每組5只，分組時個體體質(zhì)量差異小于平均體質(zhì)量的±20%。ENU給藥方式為腹腔注射，僅于首次給藥日給藥1次，其余給藥方式為經(jīng)口灌胃，連續(xù)給藥28 d，給藥體積為10 mL·kg-1。

2.2.2小鼠體質(zhì)量檢測 研究期間每天觀察小鼠癥狀，給藥及給藥結(jié)束后每周各測定2次體質(zhì)量，直至解剖結(jié)束試驗。

2.2.3TPL對小鼠Pig-a基因突變率的影響 第0、14、28、42、56天使用毛細管經(jīng)眼內(nèi)眥采血收集80～100 μL新鮮血液于K2EDTA采血管，混勻防止凝血。轉(zhuǎn)移60 μL血液置于含有100 μL 1%肝素鈉的EP管中稀釋抗凝，全部轉(zhuǎn)移至淋巴細胞分離液，離心，洗滌紅細胞(RBC)。將RBC與抗體進行2～8 ℃、避光孵育20 min，取1管溶媒對照組細胞懸液不經(jīng)抗體標記，2～8 ℃保存，作為模板調(diào)試組分A，孵育結(jié)束后離心(340×g，4 ℃，5 min)，洗脫轉(zhuǎn)移。所有細胞組均加入Anti-PE磁珠懸液置于2～8 ℃、避光孵育20 min，孵育完成后離心(340×g，4 ℃，5 min)，洗脫。柱前樣品和模板調(diào)試組分A核酸染色：向流式管中加入990 μL核酸染料-計數(shù)微球混合工作液，取10 μL細胞懸液轉(zhuǎn)移至流式管中，室溫避光孵育10 min，后置于4 ℃避光孵育5 min，此為柱前樣品。取同一溶媒對照組樣品作為模板調(diào)試組分B。搭建免疫磁性分離架，洗滌工作液潤洗，后加入上述剩余細胞懸液，上柱分離，待全部組分流出后加入洗滌工作液洗滌分選柱，用同一離心管收集洗出液，離心(800×g，4 ℃，5 min)，棄上清，向離心管中加入300 μL核酸染料-計數(shù)微球混合工作液全部轉(zhuǎn)移至流式管中，室溫避光孵育15 min。孵育完成后于2～8 ℃、避光保存至少5 min，在3 h內(nèi)上流式分析，此為柱后樣品。取相等體積(各200 μL)模板調(diào)試組分A、B充分混合，吹打均勻，即得含50%突變細胞和50%野生細胞的模板調(diào)試樣品，高速上樣，調(diào)節(jié)電壓和熒光補償，建立分析模板。建立模板后，進行柱前/后樣品檢測，高速上樣，每份柱前樣品分析1000個計數(shù)微球時停止，每份柱后樣品盡可能分析全部細胞懸液。隨后根據(jù)柱前和柱后樣本分析突變細胞數(shù)目。

因RBC無細胞核，通過核酸染料可對RBC和網(wǎng)織紅細胞(RTC)進行區(qū)分，突變型細胞表面無CD24蛋白，通過PE熒光對突變型細胞進行區(qū)分，測定網(wǎng)織紅細胞數(shù)(RET)。按照公式(3)～(4)分別計算RBC、RTC的相對突變數(shù)及RTC占比。

RTC占比=RET/RBC×100%

(4)

2.3 統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果

3.1 L5178Y細胞Pig-a基因突變實驗

3.1.1TPL的細胞毒性 TP給藥后24 h(-S9)及4 h(+S9)的RPD結(jié)果見圖1。結(jié)果表明，-S9代謝和+S9代謝狀態(tài)下TPL各質(zhì)量濃度組RPD均大于50%[12]，提示TP在給藥質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均未見明顯的細胞毒性作用。

圖1 TPL對L5178Y細胞RPD的影響

3.1.2TPL對L5178Y細胞Pig-a基因突變的影響 -S9和+S9代謝狀態(tài)下TPL給藥組24 h后培養(yǎng)8 d 時Pig-a基因突變頻率結(jié)果顯示，與對照組比較，TPL各劑量組細胞相對突變數(shù)差異無統(tǒng)計學意義，且無劑量依賴性(見圖2～3)。

注：A.-S9代謝條件；B.+S9代謝條件。圖2 -S9和+S9代謝條件下TPL對L5178Y細胞Pig-a基因突變的影響

注：與對照組比較，***P<0.001。圖3 TPL對L5178Y細胞Pig-a基因突變的影響

3.2 小鼠Pig-a基因突變實驗

3.2.1TPL對小鼠體質(zhì)量的影響 KM小鼠連續(xù)灌胃給予TPL 28 d后繼續(xù)觀察28 d，期間未見死亡。但TPL給藥組多只小鼠出現(xiàn)相互撕咬，發(fā)現(xiàn)后立即分籠飼養(yǎng)，另有尾尖壞死、毛發(fā)稀疏、精神不佳等表現(xiàn)，其中TPL 100、200 μg·kg-1組分別有3、2只，發(fā)生率為30%。實驗期間所有組小鼠平均體質(zhì)量穩(wěn)步增長，給藥組與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(見圖4)，提示連續(xù)28 d給予KM小鼠200 μg·kg-1及以下劑量TPL未產(chǎn)生明顯整體毒性。

圖4 TPL對小鼠體質(zhì)量的影響

3.2.2TPL對小鼠Pig-a基因突變率的影響 給藥第28天對照組、TPL各劑量組和ENU組柱前和柱后樣品流式結(jié)果顯示(見圖5～6)，所有組小鼠RTC占比隨實驗時間延長呈降低趨勢，在給藥28 d結(jié)束后略有升高，該現(xiàn)象可能與RBC生成減少后的代償性RTC增加有關(guān)。與對照組比較，TPL各劑量組小鼠RTC占比差異無統(tǒng)計學意義。陽性對照ENU組小鼠RBC和RTC的細胞相對突變數(shù)自給藥14 d后與相同時間點對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，提示實驗體系成立。而TPL各劑量組小鼠在首次給藥后56 d內(nèi)RBC和RTC的細胞相對突變數(shù)與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義，表明在實驗條件下，TPL 200 μg·kg-1及以下劑量對KM小鼠無堿基突變風險。

圖5 TPL對小鼠Pig-a基因突變率的影響

注：A.RTC占比；B.RBC細胞相對突變數(shù)；C.RTC細胞相對突變數(shù)；與對照組比較，*P<0.05，***P<0.001。圖6 TPL對KM小鼠Pig-a基因突變的影響

4 討論

TPL是一種環(huán)氧二萜內(nèi)酯化合物，內(nèi)酯是一種活性化學物質(zhì)，廣泛應用于化學合成、溶劑、脫漆劑和抗菌藥物的中間體。含有TPL的藥物制劑如雷公藤多苷片、雷公藤片等在臨床上應用極為廣泛，故對TPL的遺傳毒性進行研究尤為重要。內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)作為預警結(jié)構(gòu)在Toxtree的決策樹下顯示在-S9代謝條件下存在致突變風險[14，16-17]。TPL自身毒性較大，給藥劑量選擇是研究的難點之一。本課題組前期研究結(jié)果[15]顯示連續(xù)3 d給予SD大鼠TPL 450 μg·kg-1未見動物死亡。李新秀等[18]研究顯示，連續(xù)給予TPL 14 d后200 μg·kg-1組見1只KM小鼠死亡(1/6)，其解剖結(jié)果顯示臟器等無異常；連續(xù)給予TPL 28 d后，200 μg·kg-1組KM小鼠死亡率達33%(3/9)，分析其原因是動物數(shù)目較少可存在較大個體差異或因人為因素造成。綜合以上結(jié)果，本研究確定TPL最大給藥劑量為200 μg·kg-1。研究結(jié)果顯示，連續(xù)28 d給予KM小鼠TPL 200 μg·kg-1及以下劑量，未見小鼠死亡，但動物整體狀態(tài)不佳，提示200 μg·kg-1作為最大給藥劑量研究其潛在遺傳毒性致突變較合理。

本課題組在國內(nèi)首次使用L5178Y細胞建立和驗證體外Pig-a基因突變模型，L5178Y細胞自發(fā)背景突變率低，無需進行前期預清除，保證實驗靈敏度與準確性。結(jié)果顯示，在本研究條件下，TPL給藥組L5178Y細胞基因突變頻率與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義，提示無遺傳毒性致突變作用。在體內(nèi)Pig-a基因突變研究中，課題組前期連續(xù)3 d重復給予SD大鼠TPL 450 μg·kg-1，在首次給藥前和末次給藥后7、14、28、35、56 d所有時間點尾靜脈采血進行流式檢測，與對照組比較均未見Pig-a基因突變率上升[15]。本研究采用KM小鼠連續(xù)給藥28 d，并于給藥前和首次給藥后14、28、42、56 d眼內(nèi)眥采血進行流式檢測，TPL各劑量組均未見Pig-a基因突變率上升，再次驗證TPL無體內(nèi)致Pig-a基因突變作用。TPL自身結(jié)構(gòu)較大，在DNA復制過程無法模擬堿基插入DNA序列引起堿基對的改變，造成基因突變，這也與相關(guān)研究報道TPL存在遺傳毒性主要是導致染色體損傷等相一致[19-20]。本研究結(jié)果表明，TPL不具有遺傳毒性致Pig-a基因突變作用，驗證軟件預測結(jié)果，為后續(xù)研究提供參考。