黃涯，劉珂珂，呂夢，婁利霞，程涓，聶波，張冬梅，吳愛明*，趙明鏡，商洪才

1.北京中醫(yī)藥大學 東直門醫(yī)院 中醫(yī)內科學教育部和北京市重點實驗室，北京 100700；2.北京中醫(yī)藥大學 東直門醫(yī)院 病理科，北京 100700

惡性心律失常是諸多心臟疾病中最常見的并發(fā)癥之一[1]。目前臨床上所使用的抗心律失常藥物多以離子通道阻滯劑為主，存在一些不良反應，并且在降低死亡風險及改善預后方面尚不令人十分滿意[2]。心肌縫隙連接重構是心肌損傷后惡性心律失常發(fā)生的重要病理學基礎之一[3]，其核心是縫隙連接蛋白(Cx)表達的異常，其中在心肌中表達最多的為Cx43。因此，研究Cx43的病理變化及其發(fā)生機制對心律失常的防治具有積極意義[4]。

穩(wěn)心顆粒經(jīng)過長期臨床實踐，在心律失常的防治方面表現(xiàn)出良好的療效。前期動物實驗發(fā)現(xiàn)穩(wěn)心顆粒具有減輕心肌損傷、抑制凋亡的作用[5]。心肌凋亡被抑制時能夠逆轉Cx的降解過程[6]，而內質網(wǎng)應激是細胞凋亡的關鍵途徑之一。因此，本研究在細胞水平，采用毒胡蘿卜素(thapsigargin，TG)誘導內質網(wǎng)應激凋亡模型，探討內質網(wǎng)應激凋亡途徑對Cx43表達的影響，同時觀察穩(wěn)心顆粒能否通過內質網(wǎng)應激凋亡途徑調節(jié)Cx43的表達水平，為深入探討穩(wěn)心顆粒防治心律失常的作用機制提供參考。

1 材料

1.1 細胞

大鼠心肌細胞H9C2來源于大鼠胚胎期心臟組織，購自中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所細胞資源中心。

1.2 試藥

穩(wěn)心顆粒(無蔗糖型，山東步長制藥股份有限公司，批號：1806010)；TG(批號：67526-95-8)、抑制劑salubrinal(Sal)、二甲基亞砜(DMSO)，美國Sigma公司。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶，美國Gibco公司；雙抗(美國Caisson公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS，美國Hyclone公司)；Cx43、天冬氨酸胱氨酸特異性蛋白酶-12(Caspase-12)抗體，英國Abcam公司；葡萄糖調節(jié)蛋白78(GRP78)、C/EBP-同源蛋白(CHOP)抗體，美國Proteintech公司；其他試劑均為國產分析純。

1.3 儀器

MCO-20AIC型CO2培養(yǎng)箱(日本Sanyo公司)；SVE-4AL型垂直流超凈工作臺(新加坡Esco公司)；Olympus Bx60型光學倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；Varioskan LUX型酶標儀(美國Thermo Scientific公司)；CytomicsTMFC 500型單激光流式分析儀(美國貝克曼庫爾特公司)。

2 方法

2.1 H9C2細胞的培養(yǎng)

根據(jù)ATCC推薦，使用含糖4.5 g·L-1的DMEM培養(yǎng)液配制成含10%FBS的完全培養(yǎng)基，添加雙抗(青霉素100 U·mL-1，鏈霉素100 μg·mL-1)；細胞接種透氣培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5%CO2的恒溫孵育箱中靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)24～48 h，待細胞匯合度達到80%～90%并處于穩(wěn)定狀態(tài)，進行傳代或給藥處理。

2.2 溶液配制

TG粉末用DMSO配制成1 mmol·L-1原液。Sal溶液為DMSO溶解的10 mmol·L-1原液。取穩(wěn)心顆粒粉末配制成100 g·L-1的原液。所有試劑均經(jīng)0.22 μm濾網(wǎng)濾過除菌。

2.3 CCK-8比色分析法篩選藥物濃度及作用時間

采用CCK-8法檢測實驗所用試劑對H9C2細胞增殖活性的影響。將細胞稀釋至6×104個/mL，接種在96孔板中，每孔100 μL，貼壁生長24 h。實驗藥物均用完全培養(yǎng)基進行稀釋，根據(jù)試劑說明書和文獻方法[7]，設置TG的濃度梯度為0.01、0.05、0.10、0.50、1.00 μmol·L-1，作用時間為12、24、48、72 h，Sal和穩(wěn)心顆粒的濃度分別為0.1、1.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0、75.0、100.0 μmol·L-1和0.5、1.0、10.0、50.0 g·L-1，作用時間均為24 h。同時設置本底孔減少誤差，藥物刺激不同時間后加入CCK-8試劑溶液10 μL，反應1.5 h后使用酶標儀在450 nm處測定吸光度(A)值，根據(jù)公式(1)計算細胞存活率。

細胞存活率=A藥物/A對照×100%

(1)

2.4 光鏡下觀察各組H9C2細胞形態(tài)學改變

將細胞接種在6孔板中，6000個/孔，貼壁生長24 h后分為對照組、模型組、Sal(20 μmol·L-1)組和穩(wěn)心顆粒(10 g·L-1)組。除對照組外，其余各組細胞加入TG 0.10 μmol·L-1誘導內質網(wǎng)應激凋亡模型。各組加入藥物作用24 h后，在光鏡下觀察細胞生長情況及形態(tài)特征，并拍攝圖像。

2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡

采用Annexin/PI雙染法對細胞進行熒光標記，使用流式分析儀檢測。將細胞接種在6孔板中，6000個/孔，按照2.4項下分組對應處理，藥物作用24 h后收集細胞，胰酶消化，離心，PBS重懸，重復2次，加入Annexin/PI試劑盒中的Binding buffer 500 μL，重懸細胞，混勻，加入Annexin試劑5 μL，混勻，加入PI試劑5 μL，混勻，避光反應15 min，使用流式分析儀檢測分析。

2.6 Western blotting法檢測蛋白表達

將細胞接種在6孔板中，6000個/孔，按照2.4項下分組對應處理，藥物作用24 h后棄去上清，PBS沖洗2遍，每孔加入100 μL細胞裂解液，在冰上靜置10 min，每5 min搖晃混勻1次，收集6孔板中的液體在4 ℃條件下離心，收集上清，蛋白采用BCA法定量，SDS-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)進行電泳后將蛋白轉移到NC膜上，使用封閉液室溫孵育1 h，加入一抗GRP78(1∶1000)、CHOP(1∶2000)、Caspase-12(1∶500)、Cx43(1∶8000)、GAPDH(1∶5000)，4 ℃孵育過夜，三乙醇胺緩沖鹽水溶液(TBST)沖洗，室溫孵育二抗(1∶5000)，TBST沖洗，ECL發(fā)光液顯影，使用Image pro 6.0對目的蛋白表達量進行分析。

2.7 統(tǒng)計學處理

3 結果

3.1 TG、Sal及穩(wěn)心顆粒對H9C2細胞活性的影響

CCK-8比色分析結果(見圖1)顯示，TG 0.01、0.05、0.10、0.50、1.00 μmol·L-1分別處理H9C2細胞12、24、48、72 h后，對細胞活性的影響呈時間和濃度依賴性。本研究選擇達到半數(shù)抑制濃度(IC50)的條件(即0.10 μmol·L-1TG溶液處理24 h)作為造模條件；Sal溶液濃度大于40 μmol·L-1時，細胞存活率低于95%，對細胞生長產生了一定的毒性作用，因此0.1～40 μmol·L-1為Sal的無毒濃度范圍，本研究選擇Sal 20 μmol·L-1用于后續(xù)實驗；穩(wěn)心顆粒在0.5～10 g·L-1時促進細胞增殖，而在50 g·L-1時細胞存活率大幅降低，本研究選擇10 g·L-1作為穩(wěn)心顆粒組的干預條件。

注：與TG 0.01 μmol·L-1、Sal 0.10 μmol·L-1、穩(wěn)心顆粒0.5 g·L-1組比較，*P<0.05，**P<0.01；與TG 0.05 μmol·L-1、Sal 1 μmol·L-1、穩(wěn)心顆粒1 g·L-1組比較，#P<0.05，##P<0.01；與TG 0.1 μmol·L-1、Sal 10 μmol·L-1、穩(wěn)心顆粒5 g·L-1組比較，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01；與TG 0.5 μmol·L-1、Sal 20 μmol·L-1、穩(wěn)心顆粒10 g·L-1組比較，θP<0.05，θθP<0.01；與Sal 30 μmol·L-1比較，ΦP<0.05，ΦΦP<0.01。圖1 TG、Sal及穩(wěn)心顆粒對H9C2細胞活性的影響

3.2 穩(wěn)心顆粒對TG誘導的H9C2細胞形態(tài)的影響

如圖2所示，藥物作用細胞24 h后，倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)的變化。對照組H9C2細胞貼壁生長，呈長梭狀，伸展性良好，細胞呈致密束狀有序排列，無接觸抑制，細胞生長匯合度約90%；模型組細胞生長匯合度明顯降低，細胞輪廓變得不規(guī)則，失去正常鋪展外觀，分布無序，細胞呈片狀或條狀生長；而Sal組和穩(wěn)心顆粒組細胞生長匯合度顯著優(yōu)于模型組，其輪廓形態(tài)明顯改善，大致恢復致密束狀排列。

圖2 穩(wěn)心顆粒對TG誘導的H9C2細胞形態(tài)的影響(×40)

3.3 穩(wěn)心顆粒對TG誘導的H9C2細胞內質網(wǎng)應激凋亡的影響

流式細胞術檢測凋亡的結果提示，與對照組比較，模型組、Sal組及穩(wěn)心顆粒組早期凋亡率都顯著增加(P<0.05，P<0.01)。與模型組比較，Sal組及穩(wěn)心顆粒組早期凋亡率都顯著下降(P<0.01)，見表1和圖3。

表1 穩(wěn)心顆粒對TG誘導的H9C2細胞內質網(wǎng)應激凋亡的影響

圖3 穩(wěn)心顆粒對TG誘導的H9C2細胞內質網(wǎng)應激凋亡的影響

3.4 穩(wěn)心顆粒對TG誘導的H9C2細胞內質網(wǎng)應激凋亡后相關蛋白表達的影響

結果顯示，與對照組比較，模型組細胞GRP78、CHOP、Caspase-12蛋白表達水平顯著升高，Cx43蛋白表達水平顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，Sal組和穩(wěn)心顆粒組細胞CHOP和Caspase-12蛋白表達水平均顯著降低，而Cx43蛋白表達水平顯著升高(P<0.01)；Sal組細胞GRP78蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義，穩(wěn)心顆粒組細胞GRP78蛋白表達水平顯著升高(P<0.01)，見圖4。

4 討論

心肌縫隙連接由Cx構成的六聚體半通道在相鄰細胞間對接形成，縫隙連接發(fā)揮作用依賴于Cx正常表達，Cx是內質網(wǎng)合成的跨膜駐留蛋白，其合成和降解都受到內質網(wǎng)的全面調控[8]。對于心肌Cx的降解，在已經(jīng)報道的研究中，主要為未折疊蛋白反應(UPR)-內質網(wǎng)應激相關蛋白降解(ERAD)級聯(lián)的自噬和泛素途徑，受到多種因素的調控，如自噬相關蛋白的表達影響Cx43磷酸化及其降解的狀態(tài)[9]，但UPR-ERAD級聯(lián)并不完全包括Cx的降解路徑。內質網(wǎng)應激UPR通過3條信號通路發(fā)揮減少蛋白合成、增加蛋白降解、限制蛋白轉運的作用，減輕內質網(wǎng)應激以促進細胞生存，而當內質網(wǎng)應激發(fā)展到不可逆階段時，這3條信號通路便由促生存轉向促凋亡。心肌細胞發(fā)生內質網(wǎng)應激是心肌損傷后的主要病理機制之一，持續(xù)不能緩解的內質網(wǎng)應激將誘導細胞啟動凋亡程序[10]，心肌細胞凋亡過程中Cx表達的改變可能是心肌損傷后心律失常的重要原因之一[11]。

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01。圖4 穩(wěn)心顆粒對TG誘導的H9C2細胞內質網(wǎng)應激凋亡后相關蛋白表達的影響

本實驗選用內質網(wǎng)應激經(jīng)典刺激劑TG造模。TG是一種有效抑制內質網(wǎng)膜上Ca2+離子泵蛋白活性的物質，能迅速打破鈣穩(wěn)態(tài)，導致內質網(wǎng)應激[12]，TG也作為許多研究應用的凋亡誘導劑[13-14]。使用TG 0.1 μmol·L-1處理H9C2細胞24 h，結果顯示，細胞匯合度降低，形態(tài)改變，排列紊亂，出現(xiàn)明顯凋亡，且細胞內GRP78、CHOP和Caspase-12蛋白表達水平較對照組顯著提高。內質網(wǎng)分子伴侶GRP78是最經(jīng)典的內質網(wǎng)應激感受蛋白，也是UPR激活的關鍵分子之一。CHOP是UPR在內質網(wǎng)過度應激時啟動的凋亡信號分子，是UPR由促生存向促凋亡轉變的關鍵標志[15]，而Caspase-12則是內質網(wǎng)應激UPR中表達的鈣網(wǎng)蛋白直接特異性激活的Caspase蛋白，可進一步誘導激活Caspase級聯(lián)反應，水解包括Cx在內的凋亡細胞內所有蛋白[16]。以上結果表明，在TG刺激下，H9C2細胞出現(xiàn)了內質網(wǎng)應激并激活了凋亡信號分子，形成了內質網(wǎng)應激凋亡狀態(tài)。

在內質網(wǎng)應激凋亡狀態(tài)下，H9C2細胞中Cx43蛋白的表達顯著減少，這表明Cx43的表達可能與內質網(wǎng)應激凋亡密切相關。因此，本實驗進一步通過經(jīng)典凋亡抑制劑驗證了Cx43與內質網(wǎng)應激凋亡通路之間的關聯(lián)，使用凋亡抑制劑Sal與TG共同干預H9C2細胞后，細胞形態(tài)及排列分布明顯改善，Sal組細胞凋亡率顯著下降，Sal對GRP78蛋白的表達無明顯影響，但顯著下調了CHOP和Caspase-12蛋白的表達水平，上調Cx43蛋白的表達水平，說明Cx43蛋白表達量的增加可能與內質網(wǎng)應激凋亡途徑降解的抑制直接相關，進一步驗證了Cx的降解與心肌細胞內質網(wǎng)應激凋亡途徑之間的聯(lián)系。

穩(wěn)心顆粒能抑制心肌梗死后的心肌細胞凋亡，并且能夠干預Cx的表達，改善心律失常的發(fā)生[17]。本課題組前期實驗也證明了穩(wěn)心顆粒能在基因水平調控Cx43和Cx45 mRNA表達，維持兩者原有比例[18]。本研究使用穩(wěn)心顆粒和TG共同干預H9C2細胞，穩(wěn)心顆粒在一定程度上發(fā)揮了與凋亡抑制劑Sal相似的作用，這也與文獻報道中穩(wěn)心顆粒能抑制心肌細胞凋亡的結論相符合[5]。光學顯微鏡下，可見細胞形態(tài)及排列分布明顯改善，流式細胞術結果提示穩(wěn)心顆粒的干預使H9C2細胞凋亡率顯著下降，Western blotting結果進一步提示穩(wěn)心顆粒顯著上調了GRP78蛋白表達水平。有研究顯示GRP78過表達能激活多種抑制內質網(wǎng)應激的信號通路[19-21]，因此穩(wěn)心顆?？赡芡ㄟ^上調GRP78而加強細胞的自適應反應。此外，穩(wěn)心顆粒還顯著抑制了CHOP蛋白和Caspase-12蛋白的表達，而上調了Cx43蛋白的表達水平，這與文獻報道中凋亡抑制狀態(tài)下心肌縫隙連接降解過程被逆轉的結論一致[6]，說明穩(wěn)心顆?？赡芡ㄟ^減輕內質網(wǎng)應激、抑制凋亡程序激活及Caspase水解反應調控了Cx43的降解。

綜上所述，本研究結果表明，TG誘導內質網(wǎng)應激凋亡途徑的激活能夠影響H9C2細胞Cx43的表達水平，穩(wěn)心顆粒能在一定程度上抑制內質網(wǎng)應激凋亡信號分子的激活，進而抑制Cx43經(jīng)胱天蛋白酶水解途徑降解，從而發(fā)揮保護心肌縫隙連接的作用。