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        熒光PCR檢測技術(shù)對非洲豬瘟的常規(guī)監(jiān)測

        2020-12-16 10:57:11馬成立
        中國畜禽種業(yè) 2020年12期
        關(guān)鍵詞:離心管緩沖液核酸

        馬成立

        (遼寧省葫蘆島市建昌縣動物疫病預(yù)防控制中心 125300)

        非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒引起的一種急性、熱性,高度接觸性的傳染病。發(fā)病率和死亡率可達100%。世界衛(wèi)生組織將其列為法定報告的動物傳染病,我國將其列為一類動物疫病。該病雖然不是人畜共患病,無公共健康危害,但由于目前無有效的疫苗和治療方法,任其流行會給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失,造成嚴重的社會影響,沖擊畜產(chǎn)品國際貿(mào)易。我國是世界第一養(yǎng)豬大國,飼養(yǎng)量占世界總量的50%左右,切實做好非洲豬瘟病毒防控工作事關(guān)我國養(yǎng)豬業(yè)持續(xù)健康發(fā)展。

        利用實時熒光PCR 定性檢測是否存在非洲豬瘟病毒,對早期監(jiān)測,防控非洲豬瘟具有重要的指導(dǎo)意義。

        在實際工作中,我們首先選擇洛陽萊普生信息科技有限公司生產(chǎn)的核酸提取試劑盒和核酸檢測試劑盒來進行非洲豬瘟病毒檢測實驗,效果非常好。

        在實驗過程中,我們需要準備的儀器設(shè)備有數(shù)顯恒溫水浴鍋、高速冷凍離心機、生物安全柜、移液器等,還需自備無水乙醇。

        被檢樣品是動物組織,應(yīng)保存于50%甘油生理鹽水中,然后取樣約1g,用手術(shù)剪剪碎,于研缽中加入生理鹽水繼續(xù)研磨,混勻,后轉(zhuǎn)移至1.5ml 的滅菌離心管中,離心待用。如果是血液或全血樣品,則使用離心機離心析出血清后置于1.5ml滅菌離心管中待用。環(huán)境樣品則保存于病毒收集管中,離心后取上清液置于1.5ml 滅菌離心管中待用。

        無論何種樣品,實驗開始前都要在數(shù)顯恒溫水浴鍋中進行60℃的病毒滅活。

        實驗開始時首先要提取樣品核酸。采用柱狀提取法,因采用的離心吸附柱可以特異性的結(jié)合核糖核酸或脫氧核糖核酸,加之獨特的緩沖液A,緩沖液B,緩沖液C,提取的核酸純度高,質(zhì)量穩(wěn)定可靠。在試劑盒配備的緩沖液C 瓶中一定要先加入4 倍體積的無水乙醇,混勻后做好標記,備用。

        1 核酸提取

        (1)取已處理好的待檢樣品,在已開機的生物安全柜中吸取200μl 上清液加入1.5ml 的相對應(yīng)的滅菌離心管中,做好標記,然后分別加入600μl 的緩沖液A,溫和的上下顛倒混勻6~8 次,室溫靜置5min;2~8℃下用高速冷凍離心機5000r 離心1~2min,用移液器取400μl 的上清液轉(zhuǎn)入新的滅菌離心管中。

        (2)加入200μl 的無水乙醇,立即上下顛倒混勻,全部轉(zhuǎn)入已做好對應(yīng)標記的吸附柱中,靜止2min,2~8℃下12000r 離心30~60s,棄掉收集管中的廢液,將吸附柱重新放回收集管中。

        (3)向吸附柱中加入500μl 的緩沖液B,室溫下靜止2min,2~8℃下12000r 離心30~60s,棄掉收集管中的廢液,將吸附柱重新放回收集管中。

        (4)向吸附柱中加入700μl 的緩沖液C,2~8℃下12000r 離心30~60s,棄掉收集管中的廢液,將吸附柱重新放回收集管中。

        (5)2~8℃下12000r 離心2min,去除吸附柱中殘留的液體。

        (6)將吸附柱置于對應(yīng)的干凈的滅菌離心管中,開蓋晾干3~5min,向吸附膜的中間部位懸空滴加60μl 的洗脫液,室溫放置2min。

        (7)室溫下12000r 離心1min,離心管中的液體即為提取的核酸。-20℃保存或直接進行下一步實驗。

        注意事項:實驗前應(yīng)準備好盛有消毒液的容器,以便放置實驗過程中的垃圾,實驗人員必須經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)才可上崗,實驗操作的每個階段使用專用的儀器和設(shè)備,各區(qū)各階段用品不得交叉使用,各區(qū)間人員流動及空氣流向應(yīng)有嚴格要求。

        2 核酸檢測

        該檢測試劑盒檢測原理是針對非洲豬瘟病毒高度保守區(qū)域設(shè)計特異性引物和探針,在反應(yīng)體系中含有非洲豬瘟病毒基因組模板的情況下,PCR 反應(yīng)得以進行并釋放熒光信號。利用儀器對PCR 過程中相應(yīng)通道的熒光信號強度進行實時監(jiān)測和輸出,實現(xiàn)檢測結(jié)果的定性分析。該試劑盒主要組成成分有:擴增反應(yīng)液1 管,陰性對照1 管,陽性對照1 管,說明書1 份。

        實驗前20min 將試劑盒從-20℃的冰柜中取出,以平衡至室溫25℃,并使試劑完全溶解。

        (1)按照需要檢測的樣本數(shù)加上陰性對照數(shù)和陽性對照數(shù),取出PCR 反應(yīng)管,按每管17.5μl 的用量分裝到PCR 反應(yīng)管中。

        (2)加入待檢樣本提取的核酸,每管加入2.5μl,陰性對照和陽性對照管也加入2.5μl,記錄加樣順序。

        (3)蓋好PCR 反應(yīng)管蓋,將PCR 反應(yīng)液與樣本核酸震蕩混勻后2000r 離心10s。以上實驗步驟均在核酸提取室進行。

        (4)將PCR 反應(yīng)管轉(zhuǎn)移到核酸擴增區(qū),準備上機進行核酸擴增。

        (5)開機預(yù)熱并檢驗儀器性能。

        (6)取準備好的PCR 反應(yīng)管,放置在儀器樣品槽相應(yīng)位置,并記錄放置順序。

        (7)按照樣品槽上樣品位置,在儀器上進行樣品布局。

        (8)設(shè)置儀器核酸擴增相關(guān)參數(shù)進行PCR 擴增:反應(yīng)體系設(shè)為20μl,95℃30s,一個循環(huán);95℃5s,60℃40s,40 個循環(huán)。在FAM 通道采集熒光信號,ABI 系列熒光定量PCR 儀不選ROX 校正,淬滅基團選None,然后進行核酸擴增。

        3 結(jié)果分析

        (1)結(jié)果分析條件設(shè)定:閾值設(shè)定原則是合理調(diào)整閾值線,不同儀器可根據(jù)儀器噪音情況進行調(diào)整。

        (2)試劑盒中的陽性對照Ct 值小于或等于30,有明顯指數(shù)增長,呈典型的“S” 形曲線。陰性對照Ct 值大于38 或無Ct 值,線形為直線或輕微斜線,無明顯指數(shù)增長期和平臺期,則該試劑盒具有有效性。

        (3)實驗結(jié)果:如果樣品檢測結(jié)果Ct 值小于或等于35,有明顯指數(shù)增長,表明該樣品中檢測出該病毒。如果樣品檢測結(jié)果Ct 值在35~38 范圍,為可疑,此時應(yīng)對樣品進行重復(fù)檢測,如果重檢結(jié)果Ct 值仍在35~38 之間,有明顯指數(shù)增長,則判定該樣品是陽性,否則為陰性。如果被檢樣品檢測結(jié)果Ct 值大于38 或無Ct 值,表明該樣品中沒有檢測出該病毒,為陰性,結(jié)果分析后要保存當(dāng)前的分析結(jié)果,記錄好閾值。

        4 注意事項

        實驗室管理應(yīng)嚴格按照國家有關(guān)臨床基因擴增實驗室的管理規(guī)范執(zhí)行。實驗前仔細閱讀試劑盒說明書,嚴格按照操作步驟進行,避免導(dǎo)致錯誤結(jié)果。實驗過程要分區(qū)進行,分別在試劑準備室,核酸提取室,擴增反應(yīng)室進行。實驗操作的每個階段使用的儀器和設(shè)備必須專用,不得交叉使用。所有試劑均應(yīng)在規(guī)定的溫度儲存,冷凍保存的各試劑使用前應(yīng)完全融化,8000r 離心15s,使液體全部沉于管底,放于冰盒中,吸取液體時移液器槍頭盡量在液體表面層吸取,使用后立即放回冰柜,冷凍保存。使用不含熒光物質(zhì)的一次性手套,實驗過程中經(jīng)常替換手套,預(yù)防交叉污染。操作過程中吸取液體,設(shè)定時間等全部過程必須精確。為防止熒光干擾,不要在PCR 反應(yīng)管上做任何標記,并避免用手直接接觸。實驗過程中產(chǎn)生的廢棄物及試劑盒內(nèi)試劑組分在實驗中均按照具有潛在傳染性物質(zhì)處理方法進行處理。操作臺面,離心機,生物安全柜,移液器等儀器用品在實驗結(jié)束后必須用消毒液進行擦拭消毒或浸泡消毒,實驗房間在實驗結(jié)束后用紫外線燈進行消毒處理。被檢樣品在采集、儲存、運輸及核酸提取過程中操作方法不當(dāng),容易造成核酸降解而產(chǎn)生假陰性結(jié)果,當(dāng)被檢樣品核酸濃度過低時也可能產(chǎn)生假陰性結(jié)果。被檢樣品在采集和制備過程中如果發(fā)生交叉污染,容易產(chǎn)生假陽性結(jié)果。

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