冷燁

（北京王府學校 102209）

基因編輯技術(shù)是當下研究基因功能的最主要方法，也是后基因組時代的研究內(nèi)容與熱門話題[1]。 這種技術(shù)產(chǎn)生于20 世紀80 年代，使用自然狀態(tài)下同源重組對基因進行定點的敲除或替換[2]。 但由于基因編輯技術(shù)成本比較高，消耗的時間很長，極大影響了基因編輯技術(shù)的發(fā)展[3]。 直到現(xiàn)在，大多數(shù)研究也是使用同源重組來實現(xiàn)基因打靶。 不過隨著科技水平不斷發(fā)展，涌現(xiàn)出3 種不同的基因編輯技術(shù)，分別是鋅指核酸酶技術(shù)，CRISPR/Cas9 技術(shù)及轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應物核酸酶技術(shù)。 3者互相比較，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)可以在大部分細胞和個體種進行基因編輯，并且可以精準打靶及修飾[4]。 其實驗周期比較短，更加利于觀察。 本文主要綜述了CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的適應性機制和它在基因編輯領(lǐng)域的作用及在疾病模型構(gòu)建方面的貢獻。

1 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)簡介

1987 年日本Nakata 研究組在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的特殊DNA序列。 2002 年Jansen 等把帶有回文結(jié)構(gòu)的序列稱之為CRISPR序列[5]。 由于現(xiàn)代科學對基因編輯技術(shù)的要求不斷提高，CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)便應運而生。 與傳統(tǒng)電子數(shù)據(jù)交換方法相比，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)操作更加簡單，效率更高。 這種系統(tǒng)有3 大類型，其中I 型和Ⅲ型需要多種蛋白才能形成切割鏈，但 II 型只需一種。 相比之下，II 型的性能更好。 所以 II 型CRISPR/Cas 的基因打靶系統(tǒng)運用得更加廣泛，并且這種系統(tǒng)內(nèi)部所包含的Cas9 具有核酸內(nèi)切酶的活性及crRNA 和tracrRNA。另外，這種系統(tǒng)是通過同向重復的序列和間隔組成。 其中重復序列長度為21～48bp，間隔的序列長度和細菌種類與CRISPR的具體位置有關(guān)，一般的長度為26～72bp。 其引導產(chǎn)生的cr-RNA 與tracrRNA 會進行合并，同時也會引導RNA。 這種設(shè)計最大優(yōu)化了Cas9 蛋白對于特定DNA 體外定點的切割，通過CRISPR/Cas9 系統(tǒng)導入的基因編輯，其中sgRNA 會對基因組中的靶向序列進行匹配，所產(chǎn)生用來剪切基因組的酶會在基因組中產(chǎn)生一個雙鏈切口。 細胞內(nèi)部也存在非同源末端連接和源重組這2 種修復方法，因此，目標基因組可以進行任意的組合排序。 在確立CRISPR/Cas9 系統(tǒng)后，人們便開始將其用于醫(yī)療研究及動物研究，尤其表現(xiàn)在醫(yī)療中的建立疾病模型等方面。 目前看來，這種基因編輯技術(shù)已經(jīng)足夠成熟，運用于各個領(lǐng)域。

CRISPR/Cas9 不僅可以作為基因編輯工具，還可以通過創(chuàng)建目標實現(xiàn)有效的基因組編輯，當然，也有其他方面的作用。它除了在基因編輯領(lǐng)域有貢獻外，在內(nèi)源基因表達和調(diào)控上也發(fā)揮極大作用。 幾乎每一個生物體的細胞都有相同的DNA 序列，所以，使用這種系統(tǒng)進行編輯非常高效。 但細胞分化會產(chǎn)生不同的有機體。 這個成就主要是因為染色質(zhì)的獲取。 表面看來，基因組記錄了DNA 和蛋白的化學變化基因組重編程和表觀基因組編輯，是基因組編輯的一個分支，目的是在不改變基因組序列的情況下對染色質(zhì)標記和基因表達進行針對性的改變。 為了編輯具有高度空間和時間特異性的表觀基因組，基因組編輯技術(shù)其實是一種新的方法，它可以實現(xiàn)持久的基因調(diào)控，在基礎(chǔ)研究和分子醫(yī)學中有很大的發(fā)展空間。 此外，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)可以用于染色體位點的活細胞標記，這對于染色體的可視化起到很大幫助。

2 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在動物疾病模型構(gòu)建的應用

CRISPR 基因編輯技術(shù)在疾病模型建立上有很大作用。2014 年研究人員第一次通過尾靜脈注射CRISPR 系統(tǒng)進入到成年小鼠肝臟，破壞了p53 和PTEN 兩個重要的抑癌基因，由此構(gòu)建了小鼠肝臟腫瘤模型。 該模型與傳統(tǒng)的基因打靶方法構(gòu)建的腫瘤模型有很像的外形，但相比之下CRISPR 成本更低，速度更快。 另外，在尾靜脈注射帶有規(guī)定靶點的CRISPR 系統(tǒng)的同時，也注射了同源臂模板序列，由此實現(xiàn)小鼠肝臟組織中非常重要的癌基因點突變，更加體現(xiàn)出這種系統(tǒng)編輯的準確性。所以，科學技術(shù)開始致力于CRISPR 系統(tǒng)的研究并已實現(xiàn)大腦和肺部基因組編輯，由此構(gòu)建更多的疾病模型。 同時我們也了解到，使用小鼠癌變疾病模型可以更加直觀準確的觀察表型和病毒機制。 也有學者同樣利用慢病毒介導CRISPR/Cas9 系統(tǒng)對小鼠造血干細胞的基因位點進行編輯，由此又構(gòu)建出小鼠急性骨髓白血病細胞模型。 部分學者發(fā)現(xiàn)這個技術(shù)可以用于人類，于是就將CRISPR/Cas9 技術(shù)運用于人腸道癌變器官上的研究，然后進行一系列實驗與觀察，并且發(fā)現(xiàn)其中有5 種不同的癌變器官模型。 此研究表明通過激活其通路突變可以在腫瘤微環(huán)境下維持腫瘤干細胞的特性與生長。

一直以來，我科學家的實驗對象主要是小鼠，但小鼠壽命太短，生理功能及各方面與人類還存在較大差異，即使是與人類具有同樣的遺傳缺陷，小鼠也無法完整的模擬人類疾病特征。 同時，小鼠模型不能對疾病情況進行長期追蹤，極大限制了研究進度，于是科學家就開始選用豬作為科研實驗對象。 因為豬不僅自身有重要的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)價值，其繁殖性能也很好，器官大小和生理代謝過程及解剖結(jié)構(gòu)與人類很接近，尤其是心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)。 使它在生物醫(yī)藥方面具重要用途。 2014 年Hai 把Cas9mRNA 和sgRNA 注入受精卵的卵胞質(zhì)，經(jīng)過實驗獲得了vWF 基因敲除豬，制備了血管性血友病基因編輯豬模型。2015 年Zhou 和Wang 等通過CRISPR/Cas9 技術(shù)研究成功獲得了酪氨酸酶基因敲除豬、PARK2/PINK1 雙基因敲除豬和及PARKIN/DJ-1/PINK1 三基因敲除豬，由此構(gòu)建了白化病和帕金森病的動物疾病模型。 2016 年kang 等利用CRISPR/Cas9 技術(shù)獲得了RUNX3 和IL2RG 敲除豬，通過RUNX3 敲除豬的研究完美構(gòu)建了人類胃癌模型。 另外，IL2GR 敲除豬是一種免疫缺陷豬，這種豬的誕生為再生醫(yī)學和異種移植的研究有不可或缺的作用。

3 結(jié)語與展望

眾所周知，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)確實在生物基因編輯構(gòu)建和定點修飾上起重要作用，科研專家把這種技術(shù)運用于疾病模型構(gòu)建及研究遺傳變異等方面，同時也體現(xiàn)出這一技術(shù)的巨大潛力。 2013 年這種系統(tǒng)的出現(xiàn)，基因編輯就成為熱門話題。 也正是由于這種技術(shù)的興起，使我們的科研隊伍能更加簡單運用并取得突破性成果。 CRISPR 系統(tǒng)能實現(xiàn)精準的基因定點打靶及多重基因編輯。 雖然這項技術(shù)為科研提供了許多方便，但其中也存在有一些不足。 如基因治療方面還不夠完善，需要進一步優(yōu)化開發(fā)利用。 就目前來說，這種系統(tǒng)已能實現(xiàn)由2～3 個基因位點編輯基因，但如果讓其定位更多的基因位點會不會造成脫靶效應還需要進行深入研究。 盡管如此，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)仍然是一種前景無量的基因編輯技術(shù)。 這種系統(tǒng)相比其他方式更加劃算，在實際運用中更能凸顯其優(yōu)勢。 當下，科研專家正著手研究CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在人類疾病模型的構(gòu)建。