王寧

（遼寧省建平縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 122400）

血凝試驗(yàn) （HA） 是根據(jù)禽流感病毒的血凝素能與雞紅細(xì)胞發(fā)生凝集現(xiàn)象的特點(diǎn)而建立，而這種紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象可被特異性免疫血清所抑制，即紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn) （HI）。

1 操作要點(diǎn)

1.1 血清處理與保存

采血樣一般以靜脈血為主，采集后要及時(shí)分離血清，保證血清清透無溶血。血清樣品要盡早檢測或置4℃冰箱保存5d，超過一周需置—20℃冷凍保存，切忌反復(fù)凍融[1]。

1.2 稀釋液配制

HA-HI 試驗(yàn)緩沖液為 0.01mol/L，pH＝7.2 的 PBS，PBS 盡量現(xiàn)用現(xiàn)配，高壓滅菌后使用，一經(jīng)使用保存期不要超過3周。pH 要在高壓后調(diào)節(jié)，若在高壓前調(diào)到7.2，高壓后會(huì)有所改變。

1.3 1%紅細(xì)胞懸液制備

1%紅細(xì)胞懸液要現(xiàn)用現(xiàn)配，采血雞要求至少3 只SPF 成年公雞。

洗滌雞紅細(xì)胞離心轉(zhuǎn)速為1000～2000rpm，離心10min （檢測禽流感抗體時(shí)1000rpm，檢測雞新城疫抗體時(shí)2000rpm）。

洗脫好的紅細(xì)胞原液4℃保存?zhèn)溆?，配制紅細(xì)胞懸液時(shí)應(yīng)吸取試管底部的紅細(xì)胞進(jìn)行稀釋，若吸取上層紅細(xì)胞可能會(huì)導(dǎo)致懸液濃度偏低。使用前一定要搖勻，防止紅細(xì)胞下沉，保證每一孔中加入的濃度準(zhǔn)確一致。

1.4 試劑的使用與保存

凍干的病毒抗原應(yīng)按照說明書要求溶解并保存，可以無菌操作將其分裝成小包裝，以避免反復(fù)凍融，并有效減少細(xì)菌污染。

1.5 HA 試驗(yàn)

HA 試驗(yàn)測定抗原效價(jià)，做 3 個(gè)重復(fù)即可。室溫 （20～25℃） 靜置 40min 后觀察結(jié)果。判定時(shí)，可將反應(yīng)板傾斜[2]，觀察紅細(xì)胞有無淚滴狀流淌。能使紅細(xì)胞完全凝集的抗原最高稀釋度為該抗原的血凝效價(jià)，此效價(jià)為1 個(gè)血凝單位 （HAU）。注意：對(duì)照孔應(yīng)呈現(xiàn)完全不凝集，否則試驗(yàn)不成立。

HA 試驗(yàn)是對(duì)抗原效價(jià)的一個(gè)初步判定，最終要經(jīng)過4HAU 抗原回滴對(duì)抗原進(jìn)行最終校正。根據(jù)HA 試驗(yàn)結(jié)果配制4 個(gè)血凝單位 （4HAU） 的病毒抗原。例如血凝的終點(diǎn)滴度為1：256，則 4HAU 抗原的稀釋倍數(shù)應(yīng)是 1：64。

4HAU 抗原回滴同樣做 3 個(gè)重復(fù)，稀釋至第 4 列，第 5 列為紅細(xì)胞對(duì)照。

若HA 效價(jià)判定準(zhǔn)確，4HAU 抗原回滴時(shí)第1、2 孔發(fā)生凝集，第 3、4 孔流淌。

若HA 效價(jià)判定不準(zhǔn)確，4HAU 抗原回滴出現(xiàn)以下兩種情況。

（1） HA 效價(jià)判高，4HAU 抗原濃度會(huì)偏低，第 2 孔流淌，需添加抗原；

（2） HA 效價(jià)判低，4HAU 抗原濃度會(huì)偏高，第 3 孔發(fā)生凝集，需補(bǔ)加PBS。

1.6 HI 試驗(yàn)

HI 試驗(yàn)應(yīng)同時(shí)設(shè)立陰、陽性對(duì)照，添加抗原后須室溫靜置30min 后再添加1%紅細(xì)胞懸液。注意：滴加抗原和紅細(xì)胞時(shí)要從后往前加，即從低濃度向高濃度加，滴頭要懸空，不要接觸到孔里的液體；加紅細(xì)胞時(shí)要經(jīng)?；蝿?dòng)混勻，防止紅細(xì)胞下沉[3]。

結(jié)果判讀以完全抑制4 個(gè)HAU 抗原的血清最高稀釋倍數(shù)作為HI 滴度。滴度是指產(chǎn)生完全不凝集 （紅細(xì)胞完全流淌) 的最高稀釋度。

判定時(shí)需要與紅細(xì)胞對(duì)照孔進(jìn)行對(duì)照，與紅細(xì)胞對(duì)照孔紅細(xì)胞流淌速度一致，淚滴大小一致的稀釋倍數(shù)最大孔為檢測樣品的最終效價(jià)。

2 結(jié)果判定

病毒對(duì)照孔：完全凝集

RBC 對(duì)照孔：無凝集

只有陰性對(duì)照孔血清滴度不大于2log2，陽性對(duì)照孔血清誤差不超過1 個(gè)滴度的試驗(yàn)結(jié)果才有效。

測定孔：RBC 沉于孔底中心，呈紐扣狀，將板傾斜呈淚滴狀流淌。

血凝抑制試驗(yàn)效價(jià)：呈完全血凝抑制的最高血清稀釋度。禽流感HI 價(jià)小于或等于3log2 判定試驗(yàn)陰性，HI 價(jià)等于4log2 為可疑，需重復(fù)實(shí)驗(yàn)，HI 價(jià)大于或等于5log2 為陽性。

3 反應(yīng)條件

3.1 溫度

試驗(yàn)要求室溫 (20～25℃) 下操作，若環(huán)境溫度難以控制，可將反應(yīng)板置于室溫溫箱內(nèi)。

3.2 時(shí)間

孵育時(shí)間要掌握好，不論HA 還是HI 試驗(yàn)，加入紅細(xì)胞后孵育時(shí)間均為40min。但在一些病毒株中可見紅細(xì)胞從病毒中解脫，若有此情況發(fā)生，可提前判定 （25～30min） 或 4℃下孵育。總之，紅細(xì)胞對(duì)照完全凝集時(shí)即可進(jìn)行判讀。

4 小結(jié)

為了試驗(yàn)的準(zhǔn)確性，移液器要選擇合適的量程；加樣、稀釋時(shí)要注意力集中，避免漏加、復(fù)加；血清在稀釋前要充分混勻；加抗原和紅細(xì)胞時(shí)滴頭要懸空，從后往前加，以免交叉污染；嚴(yán)格控制溫度和時(shí)間；必須要進(jìn)行4HAU 抗原回滴，以避免最終結(jié)果出現(xiàn)偏差?？傊?，只有認(rèn)真對(duì)待每一步的操作，才能有效降低誤差，得到較為準(zhǔn)確的試驗(yàn)結(jié)果。