金貝諾，周芳美

（浙江中醫(yī)藥大學(xué) 醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 310000）

云南獨蒜蘭（Pleione yunnanensis Rolfe），蘭科獨蒜蘭屬的一類地生或半附生草本植物，被列為國家二級珍稀藥用植物。又名滇獨蒜蘭、糯白及、獨葉白及，多生長在貴州、云南、四川和西藏等地，常見于海拔1100～3500m處的蔭濕地帶[1-3]。其干燥假鱗莖名為山慈菇，常以復(fù)方入藥，在醫(yī)藥領(lǐng)域發(fā)揮很大的作用。但目前云南獨蒜蘭資源急劇減少，以致面臨枯竭。研究發(fā)現(xiàn)，人類對云南獨蒜蘭無限制的濫采濫挖是造成資源短缺的主要原因。本文主要從近年云南獨蒜蘭國內(nèi)外的資源現(xiàn)狀、繁殖方式等方面的研究進行綜合概述。

1 云南獨蒜蘭資源現(xiàn)狀

云南獨蒜蘭分布在中國四川、貴州、云南、西藏和緬甸北部。長期依賴其野生資源作為藥用，隨市場需求量突增，野生云南獨蒜蘭遭到毀滅性的挖掘，其野生資源儲存量銳減，導(dǎo)致價格上揚。自2008年起，山慈菇的藥材價格從30元/kg上漲到近年的260元/kg[4]，而云南獨蒜蘭的種苗則已賣價160元左右/kg，如今其已經(jīng)被列為珍稀瀕危植物。

云南獨蒜蘭對生長環(huán)境要求較高，喜四季分明的氣候和通風(fēng)、清涼的半陰環(huán)境，通常生長在疏松、透氣的蕨根、水苔或腐殖土中，易受高溫影響而迅速枯死。云南獨蒜蘭雖種植廣泛，但因為其生存條件嚴(yán)苛，缺乏完整栽培體系、生產(chǎn)規(guī)模小，以及人類長期大量采挖，導(dǎo)致其資源瀕臨枯竭。隨著云南獨蒜蘭研究的深入，其更多藥理作用將被挖掘，市場需求量只會越來越高，進而加劇供需缺口。屆時，云南獨蒜蘭可能成為珍稀的野生藥材原料。 因此尋找一種高效、快速繁殖云南獨蒜蘭的技術(shù)是當(dāng)務(wù)之急。

2 云南獨蒜蘭傳統(tǒng)繁殖方法

云南獨蒜蘭的種子的有性繁殖是目前栽種培育云南獨蒜蘭的重要方法，其花期3～4月，果期4～11月，一個蒴果內(nèi)通常含21000～34000顆種子[5]。云南獨蒜蘭繁殖一般采用自然繁殖法和分株法，生產(chǎn)上以分株法為主。一個假鱗莖每年只生長1～3個新球莖，老球莖待新球莖長成后，因養(yǎng)分耗盡而死亡，因此無性繁殖率極低。另外，云南獨蒜蘭的生長周期較長，若用傳統(tǒng)的種子繁殖，需要4～5年才能開花，而子球也需2～3年的時間，因此種群數(shù)量在自然狀態(tài)下增殖速度很慢。

2.1 自然繁殖

云南獨蒜蘭種子成熟時，胚發(fā)育尚未完全，其種皮胞質(zhì)、細(xì)胞器退化，又缺乏胚乳供給營養(yǎng)成分，導(dǎo)致種子自然萌發(fā)的死亡率高[1，6]。經(jīng)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)：在發(fā)育成原球莖時，種子死亡率高，主要以種胚變色、種胚消解的形式死亡。云南獨蒜蘭種子細(xì)小且無胚乳，天然狀態(tài)下難以獨立萌發(fā)成苗，即使發(fā)育成具備光合作用能力的幼苗，所需營養(yǎng)全部由共生菌根真菌提供，不能進行光合作用，但這類真菌對幼苗有一定的毒性，最終會引起老根腐爛。因此云南獨蒜蘭自然繁殖成功率低，難以高效繁殖。

2.2 分株法繁殖

當(dāng)前云南獨蒜蘭繁殖以分株法為主。云南獨蒜蘭繁殖多以假鱗莖作為材料，經(jīng)歷假鱗莖誘導(dǎo)、壯苗及生根、增殖與繼代、試管苗移栽五個過程[1]，成熟假鱗莖每年通過分株繁殖，大都可增殖3～4倍[7]。分株繁殖宜用休眠期的假鱗莖在秋后地上部分倒苗或者在早春栽種，分株的成熟假鱗莖上通常會有個別較小的假鱗莖，在栽培中開花的假鱗莖每次可產(chǎn)生2個能開花的假鱗莖[7]。此外，云南獨蒜蘭的分株繁殖還有許多問題亟待解決：根部脆弱，操作不當(dāng)易損傷蘭苗；根系交錯，纏繞緊密，難以分離主干；根部依靠共生菌群獲取養(yǎng)分，分株易造成益生菌群分離破壞，進而造成供氧不足，病害死亡；分株對環(huán)境條件要求嚴(yán)苛，溫度和濕度影響非常之大。

3 現(xiàn)代繁殖方法

3.1 共生萌發(fā)

蘭科種子數(shù)目龐大，進行種子的快速繁殖是一種切實有效的方法。通過共生萌發(fā)而發(fā)育的苗通常存活率較高。云南獨蒜蘭種子萌發(fā)初期，缺乏營養(yǎng)成分，真菌的入侵可以為種子供給營養(yǎng)成分和其他代謝產(chǎn)物，還可以保護種子不受外來細(xì)菌的感染。用于共生萌發(fā)的真菌需要經(jīng)過耗時較長的篩選，但一經(jīng)確定最適菌種后即可大批量生產(chǎn)。云南獨蒜蘭作為蘭科植物，其種子十分微細(xì)，不具胚乳，自然生長條件下完全依靠特定的共生真菌提供營養(yǎng)，促進其萌發(fā)和形成幼苗[8]。因此曾有人提出了利用共生萌發(fā)原理來篩選出能促進云南獨蒜蘭種子萌發(fā)的菌株，以此來提高云南獨蒜蘭的萌發(fā)率和成活率。此方法理論可行但實際操作存在很多問題，云南獨蒜蘭的生長過程中往往同時和多種真菌共生，其菌根真菌區(qū)系構(gòu)成又受到很多因素的影響，明確其中每種真菌的生態(tài)功能相對困難。而且部分分離得到的真菌對種子的促萌發(fā)作用只能持續(xù)到原球莖階段而無法保證幼苗形成，種子在繼續(xù)培養(yǎng)階段便將停止生長。不僅如此，實驗室條件下發(fā)現(xiàn)的萌發(fā)真菌應(yīng)用到天然復(fù)雜環(huán)境中是否能不受環(huán)境影響而發(fā)揮作用依然無法確定[9]。

3.2 組織培養(yǎng)

云南獨蒜蘭利用非共生萌發(fā)進行組織培養(yǎng)，即在人工培養(yǎng)基上不另外添加真菌感染使云南獨蒜蘭種子萌發(fā)。其可以高效地獲得大量幼株，因此也是目前經(jīng)濟、有效的快速繁殖方法之一。當(dāng)前比較常用的培養(yǎng)基有MS、KC、N6和RE等。張燕等認(rèn)為，在云南獨蒜蘭組織培養(yǎng)研究中[6]，可以通過外植體培育組培苗，其中以種子為外植體是最佳的方法。運用組織培養(yǎng)技術(shù)，可以解決云南獨蒜蘭傳統(tǒng)繁殖遲緩、種胚發(fā)育不全、自然條件下種子難以獨立發(fā)育成苗等問題，同時可以滿足大量繁殖云南獨蒜蘭的需求，減少野生資源的采挖，保護野生資源[10]。但組培技術(shù)在實際操作問題尚存，要綜合考慮影響實驗因素篩選出最適合云南獨蒜蘭的培養(yǎng)基和激素濃度，而且操作手法不規(guī)范或消毒不徹底會導(dǎo)致污染[11]。吳麗芳等[12]以葉片或鱗莖為外植體進行再生繁殖，結(jié)果表明二者均有缺陷，用葉片組織培養(yǎng)不能獲得大量的組培苗，而小鱗莖芽培養(yǎng)條件苛刻、培育時間過長且成功率低。李春華等[7]用無病壯實的新生的小鱗莖，接種于MS+1.0-3.0mg·L-16-BA+0.2mg·L-1NAA+3.0%濃度的蔗糖及0.55%的瓊脂，經(jīng)3個月，可產(chǎn)生原球莖。當(dāng)增殖分化成叢生芽，可在1/2MS+3.0-5.0 mg·L-16-BA+0.2-0.5 mg·L-1NAA的培養(yǎng)基上，繼續(xù)進行繼代培養(yǎng)，3個月后才分化出0.5 cm大小完整的植株小苗。此外，云南獨蒜蘭的組織培養(yǎng)病菌感染率高，消毒劑效果差[1]，10%H2O2和2%NaClO組合使用污染率可達82%以上，以2%NaClO處理7 min，10%H2O2處理5 min時，污染率為93%。如何通過改進培養(yǎng)基配方、添加物以及培育方法來進一步提高萌法率，仍是需要進一步研究的課題。只有不斷改進、完善組織培養(yǎng)技術(shù)手段，建立最優(yōu)組織培養(yǎng)快速繁殖體系，才可滿足云南獨蒜蘭大量的供給需求。

4 云南獨蒜蘭栽培技術(shù)

云南獨蒜蘭為喜光植物，適合透光率為15～40%，但陽光太強易產(chǎn)生日灼，夏季需適當(dāng)遮光、避免暴曬；春冬季節(jié)氣溫較低，需用多孔的淺盆栽培。云南獨蒜蘭適合空氣濕度為65～75%，因此澆水常采用噴澆。云南獨蒜蘭最適生長溫度為17～21℃，冬季休眠期要求2～5℃，花期最盛期12～26℃。

云南獨蒜蘭根系淺，用多孔的淺盆栽培最佳，常用苔蘚+腐殖土+沙壤為土壤搭配[12]。其培植基質(zhì)要求稀松透氣且能夠保水保肥。盆栽材料可以用附生或半附生蘭花的培植基質(zhì)，如青苔、水草、松樹皮、泥炭土和腐葉土等。盆栽時盆體下部2/3填充較粗大的顆粒，并在新生假鱗莖周圍填充細(xì)小樹皮塊和苔蘚。定植時，輕輕地將小苗移入帶基質(zhì)的營養(yǎng)缽中，深度應(yīng)為不沒及鱗莖的一半[13]。

5 云南獨蒜蘭化學(xué)成分研究

近年來，隨著人們對云南獨蒜蘭的應(yīng)用逐漸增多，國內(nèi)外學(xué)者為了進一步開發(fā)利用云南獨蒜蘭植物資源，對其化學(xué)成分進行了深入研究。迄今為止，研究人員分離云南獨蒜蘭得到有菲類、聯(lián)芐類、苷類、木脂素類、蒽醌類、黃酮類、甾體類等10種類型85個化學(xué)成分。王曉娟等[14]將云南獨蒜蘭的假鱗莖經(jīng)95%乙醇提取，并用醋酸乙酯萃取，從其中分離并鑒定了5個二氫菲、4個聯(lián)芐類化合物、2個三萜類化合物等14個化合物。Yang Wanga等[15]和PL Majumder等[16]通過層層化學(xué)對比，發(fā)現(xiàn)菲及二氫菲類和聯(lián)芐類化合物這兩類化合物具有抗腫瘤、細(xì)胞毒作用及脫粒作用等多種藥理活性。云南獨蒜蘭的藥用有效成分秋水仙堿及其衍生物秋水仙酰胺具有抑制多種動物移植性腫瘤的作用。Li Y等[17]從云南獨蒜蘭的正丁醇提取物中發(fā)現(xiàn)了一種新的化學(xué)物質(zhì)——丁烯基黃酮；Li Y等[18]從云南獨蒜蘭假鱗莖中分離得到四種新的吡咯烷酮取代的聯(lián)芐，并且發(fā)現(xiàn)這四種新物質(zhì)是兩對差向異構(gòu)物。

6 云南獨蒜蘭藥理作用

隨著科技發(fā)展，人們對云南獨蒜蘭多方面藥理作用進行深入研究，發(fā)現(xiàn)云南獨蒜蘭還具有抗腫瘤、影響造血功能、抗氧化、降脂、激活酪氨酸酶、降壓等功能。

6.1 抗腫瘤作用

云南獨蒜蘭的干燥假鱗莖是中藥山慈菇的主要來源。徐小娟等[19]通過建立動物模型，山慈菇多糖作用于小鼠H22實體瘤肝癌，檢測血清中白細(xì)胞介素-2（IL-2）、腫瘤壞死因子（TNFα）的活性高于模型組，得出山慈菇多糖一定程度上能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。葉麗芳等[20]研究不同濃度的山慈菇水提取物對胃癌細(xì)胞HGC-27的影響，通過MTT法檢測抑制率，實驗結(jié)果表明山慈菇水提取物對胃癌細(xì)胞HGC-27有體外抑制作用，且與其濃度和作用時間相關(guān)系，證明了山慈菇里的某些成分可以殺死腫瘤細(xì)胞。有學(xué)者認(rèn)為，山慈菇抑制腫瘤生長是通過抑制新生血管發(fā)生的。鑒于此，李余先等[21]采用活性跟蹤法檢測山慈菇提取物對人臍靜脈細(xì)胞株增殖的抑制率以及相應(yīng)的IC50值。實驗結(jié)果表明山慈菇提取物雖效果不及Retinoic acid，但可以抑制血管形成。Shao SY等[22]從云南獨蒜蘭的乙醇提取物中分離出了bulbocodioidins A-D，通過廣泛的NMR分析，結(jié)合實驗和計算得出的ECD（電子圓二色性）數(shù)據(jù)分析，確定了它們的結(jié)構(gòu)，并在幾種人類癌細(xì)胞系中評估了其細(xì)胞毒性作用，表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞活性，由此可得出云南獨蒜蘭有抗腫瘤作用。

6.2 影響造血功能

隨著工業(yè)的發(fā)展，由于接觸各種化學(xué)品、藥物或射線等引起的繼發(fā)性再生障礙性貧血癥發(fā)現(xiàn)率逐年增高，臨床上除了消除病因或杜絕繼續(xù)接觸這些因素外，采用中醫(yī)藥治療已使此癥的療效大為改觀。由云南獨蒜蘭的假鱗莖入藥制成的山慈菇復(fù)方制劑具有養(yǎng)陰、清熱解毒及健脾生血的效能，可顯著降低環(huán)磷酰胺及甲苯對骨髓的毒性，還可以改善外周微循環(huán)、刺激骨髓造血細(xì)胞，使髓系細(xì)胞系增生，有利于損傷機體功能的恢復(fù)。

6.3 抗氧化作用

孟海波[23]分別給小鼠進行生理鹽水和不同濃度的山慈菇多糖的連續(xù)灌胃，測定各組小鼠的血清、肝臟及腎臟中的GSH-PX、SOD、CAT、MDA和T-AOC等數(shù)值。結(jié)果顯示，對比對照組，各實驗組的小鼠血清、肝臟及腎臟中的GSH-PX、SOD、CAT活性和T-AOC都有提高；而小鼠血清、肝臟和腎臟中的MDA水平明顯降低，表明了山慈菇多糖有顯著的抗氧化作用。

6.4 降脂作用

孟海波[23]建立分別進行生理鹽水和高、中、低劑量山慈菇多糖灌胃的小鼠模型，給空白對照組飼喂全價飼料，其它各組均飼喂高脂飼料。實驗結(jié)果顯示，與模型組相比，各實驗組的小鼠血清中TG、TC和LDL-C濃度都有不程度的降低，HDL-C濃度也有不同程度的升高，證明了山慈菇多糖具有降脂作用，且達到一定劑量時才能有效降脂。

6.5 激活酪氨酸酶

酪氨酸酶是皮膚黑色素生物合成的關(guān)鍵酶，其活性降低可引起白癜風(fēng)等色素障礙性皮膚病，其基因突變則可引起白化病。能激活酪氨酸酶或者能上調(diào)其活性的物質(zhì)，在體外還能夠促黑素細(xì)胞增殖、分化，均有可能應(yīng)用于治療色素障礙性皮膚病。經(jīng)研究[24]表明，多種中藥都能夠激活酪氨酸酶，其中山慈菇的激活作用較好，可以達到治療皮膚病的效果。

7 云南獨蒜蘭臨床應(yīng)用

《云南植物志》記載云南獨蒜蘭用于矽肺、肺結(jié)核、氣管炎、熱性哮喘、咳血、消化道出血、外傷出血、燙火傷、癤腫[25]?！缎氯A本草綱要》記載云南獨蒜蘭具有清熱解毒、消炎鎮(zhèn)痛、化痰散結(jié)、癰腫療毒的療效。云南獨蒜蘭的假鱗莖通常入藥，被稱為山慈菇，其味苦、微辛、麻，性涼。山慈菇在臨床上常用于抗腫瘤，且多以復(fù)方入藥，效果良好?！吨袊幍洹分羞€將云南獨蒜蘭與獨蒜蘭的干燥假鱗球莖二者合稱為冰球子，且作藥材性狀和鑒別[26]。

8 展望

云南獨蒜蘭物種珍貴，是我國傳統(tǒng)名貴中藥，藥理功效顯著。目前我國云南獨蒜蘭資源短缺，產(chǎn)量難以滿足市場需求，造成供不應(yīng)求的市場現(xiàn)狀，使云南獨蒜蘭價格抬高。不僅如此，云南獨蒜蘭種質(zhì)大大降低，很大程度地限制了獨蒜蘭產(chǎn)業(yè)的開發(fā)和發(fā)展。因此，有效保護云南獨蒜蘭資源已刻不容緩。云南獨蒜蘭植物種子細(xì)小，天然狀態(tài)下難以獨立萌發(fā)成苗，因此有必要建立一種快速的現(xiàn)代云南獨蒜蘭繁殖技術(shù)，這對于解決云南獨蒜蘭資源問題具有十分重要的現(xiàn)實意義。

目前國內(nèi)外對云南獨蒜蘭快速繁殖技術(shù)的研究較少，研究者多采用傳統(tǒng)的分株法培育云南獨蒜蘭，此類方法未能有效解決云南獨蒜蘭資源緊缺的問題，還有使其因病毒累積而使品種退化的風(fēng)險。人工種子技術(shù)成本低、體積小、機械化程度高，是目前藥用植物快速繁殖的常用方法。此外，目前人們也缺乏對云南獨蒜蘭資源現(xiàn)狀的深入探索。因此有必要廣泛收集云南獨蒜蘭的種質(zhì)資源，并不斷改進云南獨蒜蘭快速繁殖技術(shù)。相信隨著研究的深入，采用高效的現(xiàn)代繁殖技術(shù)，結(jié)合傳統(tǒng)優(yōu)良種植模式，將有效解決云南獨蒜蘭的資源短缺問題。