何 蕾，陰 晴，周亞玲，吳 瑤

(江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科,江蘇鎮(zhèn)江 212001)

銅綠假單胞菌(PA)是一種非發(fā)酵型革蘭陰性桿菌，也是引起醫(yī)院內(nèi)獲得性感染的主要條件致病菌之一，廣泛分布于自然環(huán)境和醫(yī)療環(huán)境中。近年來，隨著新型廣譜β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物在臨床中的廣泛使用，PA在抗菌藥物的選擇性壓力下其耐藥性發(fā)展迅速，多重耐藥株及泛耐藥株分離率逐年提高。目前β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類及喹諾酮類藥物仍是治療PA感染主要藥物，其中碳青霉烯類抗菌藥物在治療革蘭陰性桿菌感染中療效顯著，但由于PA對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥性上升迅速，其治療效果并不令人滿意，常導(dǎo)致臨床出現(xiàn)無藥可用的狀況。PA的耐藥機(jī)制復(fù)雜，主要有可移動性基因元件、β-內(nèi)酰胺酶的水解作用、主動外排泵的高表達(dá)、外膜通透性降低及生物膜的形成等[1-3]。其中可移動性基因元件中的整合子具有強(qiáng)大的耐藥基因捕獲能力，在耐藥基因的傳播中起到至關(guān)重要的作用。通常情況下，PA耐藥的形成是多種機(jī)制共同作用的結(jié)果。本研究選取本院4株不同耐藥程度且攜帶Ⅰ類整合酶基因(IntⅠ)的PA菌株開展研究，分析4株IntⅠ陽性菌株的耐藥機(jī)制之間的相互作用，為臨床合理用藥及控制院內(nèi)感染提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1菌株 4株IntⅠ陽性的PA分離自江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院微生物室，編號為PA01和PA02是亞胺培南(IMP)耐藥PA(IRPA)，PA03和PA04是IMP敏感PA(ISPA)。標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株P(guān)A ATCC27853和大腸埃希菌ATCC25922購于原衛(wèi)生部臨床檢驗中心。

1.2主要儀器 VITEK-2 compact全自動微生物鑒定和藥敏分析儀購自法國生物梅里埃公司；Real-Time PCR儀、普通PCR擴(kuò)增儀和凝膠電泳成像分析系統(tǒng)均購自美國Bio-Rad公司；水平電泳套件購自上海天能生物公司；MULTISKAN GO全波長酶標(biāo)分析儀、低溫高速離心機(jī)、NanoDrop1000分析儀為美國Termo公司產(chǎn)品；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板購自德國Eppendorf公司；GRANT-PCH-1干式加熱/冷卻器購自上海恒奇儀器儀表有限公司；恒溫水浴鍋購自嘉興俊思電子有限公司。

1.3主要試劑 血瓊脂平購自鄭州安圖生物公司；胰蛋白胨，酵母干粉購自英國OXOID公司；小量質(zhì)粒提取試劑盒，膠回收試劑盒購自上海捷瑞生物有限公司；2×qPCR SYBR Green Mix、2×PCR Master Mix、QRT SuperMix for qPCR購自南京Vazyme公司；細(xì)菌總RNA快速抽提試劑盒購自上海生工生物公司；異丙醇、氯仿和無水乙醇等均為國產(chǎn)分析純；DNA Marker購自大連寶生物公司；PCR引物由蘇州泓訊生物技術(shù)公司合成；瓊脂糖粉末購自西班牙Biowest公司；1%結(jié)晶紫染液購自珠海貝索公司；頭孢他啶(CAZ)粉末1 g購自揚(yáng)子江藥業(yè)；IMP粉末500 mg購自杭州默沙東。

1.4方法

1.4.1細(xì)菌培養(yǎng)、菌種鑒定及藥敏檢測 所有菌株的分離和培養(yǎng)嚴(yán)格按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程(第4版)》操作。采用VITEK-2 compact微生物鑒定及藥敏系統(tǒng)配套的鑒定卡及藥敏卡對細(xì)菌進(jìn)行鑒定，并檢測其對抗菌藥物的敏感性。

1.4.2細(xì)菌DNA模板的制備 采用煮沸裂解法制備細(xì)菌總DNA，操作步驟為從血平板上挑取3～5個菌落接種于300 μL滅菌蒸餾水中并振蕩混勻，煮沸10 min以裂解細(xì)菌，經(jīng)12 000 r/min離心10 min后收集上清液即為DNA模板。

1.4.3PA菌最低抑菌濃度(MIC)檢測 以LB培養(yǎng)基倍比稀釋一系列濃度的CAZ和IMP，96孔細(xì)菌培養(yǎng)板每孔加入100 μL不同濃度的CAZ和IMP，同時設(shè)置不加抗菌藥物的對照組。新鮮菌落以生理鹽水調(diào)節(jié)濃度至0.5 McF，再以LB培養(yǎng)基以1∶1 000比例稀釋后每孔加入100 μL，同時設(shè)置未加菌的空白對照組，只加入相同體積的LB培養(yǎng)液。每組重復(fù)3次。細(xì)菌培養(yǎng)板于37 ℃中培養(yǎng)24 h，采用酶標(biāo)儀讀取吸光度600 nm處的數(shù)值(A600)，當(dāng)A600≤0.1時認(rèn)定無細(xì)菌生長，記錄無細(xì)菌生長孔對應(yīng)的抗菌藥物最低濃度。

1.4.4CAZ和IMP誘導(dǎo)細(xì)菌IntⅠ mRNA的表達(dá) 配制含抗菌藥物濃度為10、5、1、0.1、0.01 μg/mL的LB培養(yǎng)基，同時設(shè)置不添加抗菌藥物對照組。4株P(guān)A菌分別接種于上述含不同濃度抗菌藥物的培養(yǎng)基，每組重復(fù)3管，試驗重復(fù)3次。于37 ℃振蕩培養(yǎng)8 h后，收集菌體，采用上海生工公司RNA快速抽提試劑盒提取細(xì)菌總RNA，以南京諾唯贊公司RT SuperMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，用于后續(xù)qPCR檢測。qPCR檢測引物參考劉蓉等[4]研究報道合成，qPCR檢測體系包括cDNA模板2 μL，上、下游引物各0.4 μL，qPCR Mix預(yù)混液10 μL，最終以滅菌蒸餾水補(bǔ)足體系至20 μL。qPCR反應(yīng)條件為，95 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，反應(yīng)共40個循環(huán)，于退火階段收集熒光信號。計算平均Ct值，采用2-ΔΔCt法計算獲得被測基因的相對表達(dá)水平。

1.4.5β-內(nèi)酰胺酶基因檢測 參考閆玉蘭[5]研究合成檢測引物。PCR反應(yīng)總體系為25 μL，其中2×PCR預(yù)混液 12.5 μL，上、下游引物(10 pmol/L)各0.5 μL，DNA模板2 μL，加滅菌蒸餾水至25 μL。PCR反應(yīng)程序為94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。通過1.2%瓊脂糖凝膠檢測PCR產(chǎn)物，并照相記錄結(jié)果。

1.4.6主動外排泵和外膜蛋白基因檢測 參考文獻(xiàn)[5-6]合成外排泵和外膜蛋白引物。PCR反應(yīng)總體系同1.4.5，PCR反應(yīng)程序為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。通過1.2%瓊脂糖凝膠檢測PCR產(chǎn)物，并照相記錄結(jié)果。參照1.4.4對OprM、OprD2進(jìn)行qPCR檢測。見表1。

表1 目的基因引物序列

續(xù)表1 目的基因引物序列

1.4.7生物膜形成能力檢測 采用結(jié)晶紫染色法體外檢測PA生物膜形成能力。取出凍存的PA菌種接種于血平板上，35 ℃培養(yǎng)18 h，挑取單個菌落于無菌生理鹽水中，調(diào)節(jié)比濁度為1 McF的菌懸液，在96孔板，每孔加入10 μL菌液和200 μL的LB培養(yǎng)液，每株菌做3個平行對照，同時設(shè)置陰性對照，35 ℃置于濕盒中連續(xù)培養(yǎng)48 h。48 h后取出96孔板，吸棄板內(nèi)培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液洗滌3次去除黏附菌(使用棉簽將各孔外壁的結(jié)晶紫小心擦盡)，每孔加入固定液(甲醇)200 μL固定20 min；固定完畢后，再用磷酸鹽緩沖液洗滌2次；晾干后各孔加入200 μL 1%結(jié)晶紫染液，室溫下染色10 min。染色完畢后蒸餾水洗滌2次，晾干，最后各孔加入95%乙醇200 μL，充分溶解。酶標(biāo)儀讀取570 nm處的吸光度值(A570)。試驗菌株吸光度值大于陰性對照孔即為生物膜形成陽性。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS25.0統(tǒng)計學(xué)軟件，采用one-way ANOVA及LSD-t檢驗分析一系列抗菌藥物濃度下PA的IntⅠ的相對表達(dá)水平，采用獨(dú)立樣本t檢驗分析OprM、OprD2及生物膜在不同組間的差異。以上統(tǒng)計方法均以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1CAZ、IMP的MIC檢測結(jié)果 CAZ對PA01、PA02、PA03、PA04的MIC分別是64、64、2、4 μg/mL；IMP對PA01、PA02、PA03、PA04的MIC分別是16、16、0.5、0.5 μg/mL。

2.2PA在不同濃度CAZ、IMP誘導(dǎo)下IntⅠ mRNA的相對表達(dá)水平 PA01、PA02在CAZ(10 μg/mL)、IMP(10 μg/mL，5 μg/mL)培養(yǎng)基中，細(xì)菌生長受到抑制；PA03、PA04在CAZ(10 μg/mL，5 μg/mL)、IMP(10 μg/mL，5 μg/mL)培養(yǎng)基中，細(xì)菌生長受到抑制，故棄之不用。圖1顯示：PA01、PA02、PA04菌株的IntⅠ mRNA的相對表達(dá)水平均較對照組高(P<0.05)，并且PA01、PA02的IntⅠ mRNA相對表達(dá)水平高于PA04；組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，并且在一定濃度范圍內(nèi)，IntⅠ的mRNA相對表達(dá)水平隨著培養(yǎng)液中抗菌藥物的濃度增加而呈上升趨勢。但是PA03菌株的IntⅠ的mRNA相對表達(dá)水平比PA01、PA02、PA04低，且組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

注：A為CAZ誘導(dǎo)下PA IntⅠ mRNA的相對表達(dá)水平；B為IMP誘導(dǎo)下PA IntⅠ mRNA的相對表達(dá)水平。

2.3PA的β-內(nèi)酰胺類酶檢測結(jié)果 PA01、PA02檢測到blaTEM，所有菌株未檢測到blaNDM-1、blaVIM和blaIMP。見圖2。

圖2 PA TEM基因擴(kuò)增電泳圖

2.4PA的外排泵及外膜蛋白檢測結(jié)果 外排泵的PCR結(jié)果顯示PA01、PA02的MexA、MexB、OprM均陽性，PA03、PA04的MexA、MexB陽性，OprM陰性，并且PA01、PA02的外排基因OprM的mRNA相對表達(dá)水平是PA03、PA04的519倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。4株P(guān)A的外膜蛋白基因OprD2均為陽性，并且PA01、PA02的OprD2的mRNA相對表達(dá)水平低于PA03、PA04，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

2.5生物膜形成能力體外測定結(jié)果 4株P(guān)A的生物膜形成能力均為陽性，分別為：0.20±0.02、0.32±0.05、3.81±0.12、0.85±0.03，結(jié)果顯示PA01、PA02的生物膜形成能力弱于PA03、PA04，且PA03菌株的生物膜形成能力最強(qiáng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

注：A為PA主動外排基因擴(kuò)增電泳圖；B為PA主動外排基因OprM mRNA的相對表達(dá)水平與細(xì)菌耐藥的關(guān)系。IRPA(PA01、PA02)與ISPA(PA03、PA04)比較，*P<0.05。

注：A為PA外膜蛋白基因擴(kuò)增電泳圖；B為PA外膜蛋白基因OprD2 mRNA相對表達(dá)水平與細(xì)菌耐藥的關(guān)系。IRPA(PA01、PA02)與ISPA(PA03、PA04)比較，*P<0.05。

3 討 論

近年來，隨著廣譜抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，PA在抗菌藥物的選擇性壓力下，多重耐藥菌株不斷增加，甚至出現(xiàn)泛耐藥菌株，但是其耐藥的形成并非單一耐藥機(jī)制介導(dǎo)，而是多種耐藥機(jī)制相互作用結(jié)果，給臨床的抗感染治療帶來了難題，應(yīng)引起廣泛重視[7]。

整合子是細(xì)菌重要的可移動性元件，通過位點特異性重組捕獲外源耐藥基因使之表達(dá)并在不同菌株之間廣泛傳播[8]。本研究主要探討CAZ、IMP的不同濃度對PA菌株IntⅠ表達(dá)的影響，結(jié)果顯示PA01、PA02、PA04菌株在CAZ、IMP的誘導(dǎo)下，隨著抗菌藥物濃度的升高，IntⅠ mRNA相對表達(dá)水平上升，且IRPA IntⅠ mRNA的相對表達(dá)水平更高，進(jìn)一步說明IntⅠ基因在抗菌藥物的壓力下，會上調(diào)其表達(dá)，從而提高整合酶對耐藥基因的捕獲概率，有利于細(xì)菌多重耐藥的形成，這與GUERIN[9]等的研究報道相符。但是PA03菌株的IntⅠ mRNA在抗菌藥物誘導(dǎo)下，相對表達(dá)水平較低，且無統(tǒng)計學(xué)意義，考慮菌株個體差異或者該菌株的耐藥并非是由整合子介導(dǎo)的，可能由其他耐藥機(jī)制介導(dǎo)，將在后面進(jìn)一步闡述。

PA中對抗菌藥物有水解作用的β-內(nèi)酰胺酶按Ambler結(jié)構(gòu)分類分成A、B、C、D 4類。其中A類酶包括質(zhì)粒介導(dǎo)的TEM、KPC-1酶和GES-2酶；B類酶主要是金屬酶包括IMP、VIM、SPM、GIM、NDM-1型，C類酶主要是染色體編碼的AmpC酶；D類酶大部分是苯唑西林水解酶，即OXA型-1[10-11]。本研究中，PA01、PA02檢測到blaTEM,其余β-內(nèi)酰胺酶(blaNDM-1、blaVIM、blaIMP)均未檢測到，說明產(chǎn)酶因素在本院PA對碳青霉烯類藥物耐藥中的作用并不是主要的。

主動外排系統(tǒng)在PA耐藥中起到重要作用，多藥外排的存在可能是導(dǎo)致PA多重耐藥形成的主要機(jī)制。MexAB-OprM是第一個發(fā)現(xiàn)的外排系統(tǒng)，也是PA對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥最主要的外排系統(tǒng)[12]。有文獻(xiàn)[13]報道MexAB-OprM外排泵由MexA、MexB和OprM 3種蛋白組成，操縱子MexO同時編碼這3種蛋白，因此可利用定量檢測其中一個基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平來反映外排泵MexAB-OprM的表達(dá)情況。本研究通過反轉(zhuǎn)錄外膜蛋白OprM基因的mRNA，觀察MexAB-OprM mRNA的相對表達(dá)水平，結(jié)果顯示IRPA菌株外排泵表達(dá)水平高于ISPA(P<0.05)，表明主動外排的過量表達(dá)參與了PA對碳青霉烯類藥物耐藥的機(jī)制。

OprD2是以IMP為代表的碳青霉烯類抗菌藥物(美羅培南除外)進(jìn)入菌體的特異性通道，具有配體特異性，能形成IMP的特異性結(jié)合位點[12]。有學(xué)者認(rèn)為PA對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥主要是由于OprD2表達(dá)減少甚至缺失引起外膜通透性下降所致[12]，也有研究認(rèn)為單純OprD2基因缺失僅表現(xiàn)對IMP低水平耐藥，總是和其他因素(主動外排系統(tǒng)、β-內(nèi)酰胺酶)一起作用才對碳青霉烯類藥物產(chǎn)生明顯耐藥[13]。本研究中，IRPA菌株的OprD2 mRNA的相對表達(dá)水平低于ISPA菌株(P<0.05)，進(jìn)一步表明IRPA對碳青霉烯類耐藥可能是由于外膜蛋白的表達(dá)減少，不能使抗菌藥物進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)，從而介導(dǎo)耐藥。

生物膜是細(xì)菌與其分泌的胞外基質(zhì)相互粘連形成的具有特定結(jié)構(gòu)和功能的細(xì)胞群體[14]。生物膜一旦形成，抗菌藥物難以滲透入細(xì)胞膜內(nèi)，無法發(fā)揮抑菌或殺菌作用，表現(xiàn)為細(xì)菌對抗菌藥物的耐藥性增加，所以細(xì)菌耐藥與生物膜關(guān)系密切[15-16]。但是也有研究表明生物膜是細(xì)菌為了適應(yīng)環(huán)境而存在的一種方式，與細(xì)菌耐藥關(guān)系不大[14,17]。本研究中，ISPA的生物膜形成能力強(qiáng)于IRPA(P<0.05)，且PA03菌株的生物膜形成能力最強(qiáng)，分析原因如下：(1)細(xì)菌生物膜形成與耐藥性是細(xì)菌在惡劣條件下生存的兩種能力。ISPA由于耐藥率低，會形成更強(qiáng)的生物膜來適應(yīng)環(huán)境的變化，逃避抗菌藥物及機(jī)體免疫系統(tǒng)的攻擊；IRPA一旦形成生物膜，將很難徹底清除，給臨床抗感染治療帶來困難；(2)生物膜的體外測定需連續(xù)培養(yǎng)48 h，而抗菌藥物敏感性試驗所需時間為12～16 h(甚至更短)，尚不足以形成成熟的生物膜；(3)考慮本試驗菌株數(shù)量較少，課題組將進(jìn)一步加大菌株數(shù)量來加以驗證。

4 結(jié) 論

PA01、PA02、PA04的IntⅠ在抗菌藥物的選擇性壓力下表達(dá)增強(qiáng)，意味著攜帶整合子的細(xì)菌捕獲外源耐藥基因的概率大大提高，有利于耐藥性迅速形成及耐藥范圍擴(kuò)大，嚴(yán)重威脅人類健康，應(yīng)引起臨床廣泛重視。此外，IRPA的主動外排表達(dá)能力強(qiáng)于ISPA，細(xì)胞外膜通透性、生物膜形成能力低于ISPA，故PA01、PA02對碳青霉烯類耐藥主要由整合酶基因高表達(dá)、外排泵過表達(dá)及膜通透性下降介導(dǎo)，與β-內(nèi)酰胺酶及生物膜形成關(guān)系不大。PA03菌株IntⅠ mRNA相對表達(dá)水平低，生物膜形成能力最強(qiáng)，考慮其耐藥機(jī)制主要由生物膜介導(dǎo)。