陳書恩，趙 丹，周明德，陳 相，劉志偉，楊小猛，張秀明

(1.廣東省深圳市羅湖醫(yī)院集團(tuán)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，廣東深圳 518000；2.廣東省深圳市羅湖區(qū)婦幼保健院檢驗(yàn)科，廣東深圳 518019；3.廣東省深圳市羅湖區(qū)慢性病防治院檢驗(yàn)科，廣東深圳 518023；4.廣東省深圳市羅湖區(qū)婦幼保健院人力資源部，廣東深圳 518019；5.廣東省深圳市羅湖區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，廣東深圳 518000)

先天性免疫系統(tǒng)是宿主防御的第一道防線，由固有免疫屏障、固有免疫細(xì)胞和固有免疫分子組成[1]?？咕?AMP)是重要的固有免疫分子，具有廣譜抗菌活性，包括防御素和cathelicidins兩大主要的AMP家族[2-3]。氣道上皮細(xì)胞是先天性肺部免疫系統(tǒng)的組成部分，能分泌β防御素等多種AMP[4]。以往研究發(fā)現(xiàn)采用β防御素治療嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠，可以降低其皮下組織中的細(xì)菌水平[5]。

過敏性哮喘是一種以肺嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和氣道高反應(yīng)性為特征的IgE介導(dǎo)的慢性炎癥性疾病[6]。難治性哮喘是氣道感染的危險(xiǎn)因素，過敏性氣道炎癥抑制了氣道抗菌宿主防御機(jī)制[7-8]。過敏原特異性免疫療法(ASIT)是目前治療過敏性哮喘的唯一有效方法。然而，尚不清楚采用塵螨疫苗免疫治療是否影響氣道抗菌宿主防御反應(yīng)。因此，本研究擬建立粉塵螨過敏性哮喘小鼠模型，并采用塵螨疫苗免疫治療，探討塵螨疫苗免疫治療對(duì)哮喘小鼠氣道上皮細(xì)胞β防御素3(MBD-3)表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，從而為治療哮喘提供新思路。

1 材料與方法

1.1材料來源 24只雌性BALB/c小鼠(16～22 g、6～8周齡)購(gòu)自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)院無特定病原體(SPF)級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都獲得了深圳大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2試劑與儀器 銅綠假單胞菌由深圳市羅湖區(qū)婦幼保健院臨床微生物室提供。粉塵螨由深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)院過敏反應(yīng)與免疫學(xué)研究室提供，于恒濕(相對(duì)濕度75%±1%)、恒溫(27±0.5)℃培養(yǎng)室中隔離培養(yǎng)。兔抗小鼠MBD-3多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，F(xiàn)TIC標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗購(gòu)自丹麥Envision公司，RPMI-1640培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，SYBR反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，蘇木精-伊紅(HE)染液、瑞氏染液和革蘭染液購(gòu)自珠海貝索公司。DM3000LED型熒光顯微鏡為德國(guó)徠卡公司產(chǎn)品，ABI 7500型PCR儀為美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司產(chǎn)品。MBD-3熒光染色強(qiáng)度分析軟件為ImageJ 1.48v。

1.3塵螨疫苗制備 將研缽、勻漿器洗凈烘干備用。稱取-20 ℃保存的粉塵螨4 g，倒入研缽中，用液氮充分研磨成粉末，轉(zhuǎn)移到勻漿器中，加入5 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)和適量的蛋白酶抑制劑，冰上操作，充分勻漿2 h，然后4 ℃下攪拌2 h。4 ℃ 12 000 r/min離心5 min，吸取中間層蛋白，避免吸到最上層的脂質(zhì)和沉淀。再按照上述方法離心2～3次，直到溶液完全澄清。用BCA法測(cè)定蛋白濃度，以PBS為稀釋液配制成蛋白終濃度為5 g/L的溶液，經(jīng)0.22 μm的無菌濾膜過濾，以去除雜質(zhì)和細(xì)菌，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4粉塵螨過敏性哮喘小鼠模型的建立和實(shí)驗(yàn)方案 BALB/c小鼠隨機(jī)分為4組，每組6只，即非哮喘組、非哮喘感染組、哮喘感染組和哮喘感染治療組。在第0、7和14天，哮喘感染組和哮喘感染治療組每只小鼠用50 μg塵螨疫苗加2 mg明礬進(jìn)行腹膜內(nèi)致敏。從第28天(每2天，總共3次給藥)開始，分別用等體積PBS(哮喘感染組)、0.1 g塵螨疫苗(哮喘感染治療組)對(duì)小鼠進(jìn)行舌下給藥。完成最終免疫7 d后，哮喘感染治療組每天再用50 μg塵螨疫苗對(duì)小鼠進(jìn)行鼻內(nèi)攻擊，持續(xù)7 d；采用PBS同樣方法處理非哮喘組和非哮喘感染組。用乙醚麻醉非哮喘感染組、哮喘感染組和哮喘感染治療組小鼠，然后在鼻內(nèi)感染1×107個(gè)菌落的銅綠假單胞菌，非哮喘組小鼠接受等量PBS。24 h后處死小鼠，取支氣管肺泡灌洗液(BALF)、肺組織備用。

1.5組織病理學(xué)分析和免疫熒光組織化學(xué) 室溫下將肺組織固定在4%冷甲醛溶液中24 h，石蠟包埋，制備成厚度為5 μm的系列切片。一部分切片用HE染色，光學(xué)顯微鏡檢查組織學(xué)變化。另一部分切片脫蠟、再水合。用0.3%過氧化氫封閉內(nèi)源過氧化物酶活性，室溫下孵育10 min。用枸櫞酸鹽(pH=6)在95 ℃水浴中進(jìn)行抗原回收，持續(xù)40 min。將切片與抗MBD-3的兔多克隆抗體(1∶300)在37 ℃孵育45 min，然后再應(yīng)用FTIC標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(1∶500)37 ℃孵育45 min。最后，在熒光顯微鏡下觀察熒光強(qiáng)度，采用ImageJ 1.48v軟件分析得到相對(duì)熒光強(qiáng)度。

1.6瑞氏染色和革蘭染色 收集小鼠BALF，4 ℃、400×g離心3 min。除去上清液并加入100 μL PBS以重懸樣品。取懸浮液涂片，一部分涂片用瑞氏染液染色，在光學(xué)顯微鏡高倍視野(HP)下計(jì)數(shù)涂片中炎癥細(xì)胞的數(shù)量。另一部分涂片用革蘭染液染色，在光學(xué)顯微鏡油鏡視野下計(jì)數(shù)涂片中革蘭陰性桿菌的數(shù)量。

1.7細(xì)菌的定量 無菌操作將肺組織取出，稱重，并在RPMI 1640培養(yǎng)液中勻漿，將懸浮液接種在銅綠假單胞菌選擇性平板上，37 ℃孵育24 h后，計(jì)數(shù)細(xì)菌菌落形成單位(CFU)。

1.8MBD-3 mRNA表達(dá)水平檢測(cè) 參照試劑盒說明書，用Trizol試劑從小鼠肺組織中提取總RNA，采用cDNA合成試劑盒制備相應(yīng)的cDNA。反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)的引物如下：MBD-3，上游引物5′-GCATTTGGCAACTCGTCAG-3′和下游引物5′-TGGAGGCAAAATCTGGTGT-3′；內(nèi)參照β-肌動(dòng)蛋白，上游引物5′-CCTGACTGACTACCTCATGAAG-3′和下游引物5′-CGACCATCCTCCTCTCTGATAG-3′。在ABI-7300型PCR儀上采用SYBR綠色聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒完成反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)。反應(yīng)條件為cDNA合成和變性：45 ℃、40 min， 95 ℃、5 min；PCR擴(kuò)增：35個(gè)循環(huán)，94 ℃、30 s，60 ℃、45 s，72 ℃、2 min。熔解曲線法分析驗(yàn)證反應(yīng)產(chǎn)物，用2-ΔΔCt法計(jì)算MBD-3對(duì)β-肌動(dòng)蛋白的相對(duì)mRNA水平。

2 結(jié) 果

2.14組小鼠肺部炎癥比較 4組小鼠肺組織HE染色顯示哮喘感染治療組小鼠肺部中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)比哮喘感染組小鼠輕，見圖1A。BALF沉渣瑞氏染色涂片的中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)比較，哮喘感染組高于哮喘感染治療組(q=107.334，P<0.05)、非哮喘感染組(q=143.112，P<0.05)和非哮喘組(q=250.447，P<0.05)，哮喘感染治療組高于非哮喘感染組(q=35.778，P<0.05)和非哮喘組(q=143.113，P<0.05)，非哮喘感染組高于非哮喘組(q=107.334，P<0.05)，見圖1B、C。

2.24組小鼠肺組織勻漿及BALF中細(xì)菌載量比較 小鼠肺組織勻漿培養(yǎng)，顯示哮喘感染組細(xì)菌菌落數(shù)高于非哮喘感染組(q=1 252.234，P<0.05)和哮喘感染治療組(q=1 010.732，P<0.05)，哮喘感染治療組高于非哮喘感染組(q=241.502，P<0.05)，非哮喘組小鼠肺組織勻漿培養(yǎng)后細(xì)菌菌落數(shù)為0，見圖2A、B。小鼠BALF沉渣涂片進(jìn)行革蘭染色，哮喘感染組細(xì)菌菌落數(shù)高于非哮喘感染組(q=250.447，P<0.05)和哮喘感染治療組(q=205.724，P<0.05)，哮喘感染治療組高于非哮喘感染組(q=44.723，P<0.05)，非哮喘組BALF沉渣細(xì)菌數(shù)為0，見圖2C、D。

注：A為小鼠氣道和肺組織切片HE染色(×200)；B為BALF離心沉淀，沉渣涂片，瑞氏染色(×400)；C為每HP平均細(xì)胞計(jì)數(shù)(個(gè)/高倍視野)。哮喘感染組與非哮喘感染組、哮喘感染組與哮喘感染治療組、哮喘感染治療組與非哮喘感染組比較，*#△P<0.05。

注：A為4組小鼠肺組織勻漿在銅綠假單胞菌選擇性血瓊脂平板上培養(yǎng)后形成的細(xì)菌菌落；B為4組小鼠BALF沉渣涂片的革蘭染色結(jié)果，箭頭所示為銅綠假單胞菌；C為4組小鼠肺組織勻漿培養(yǎng)細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)結(jié)果；D為4組小鼠BALF細(xì)菌菌落數(shù)計(jì)數(shù)結(jié)果。哮喘感染組與非哮喘感染組、哮喘感染組與哮喘感染治療組、哮喘感染治療組與非哮喘感染組比較，*#△P<0.05。

2.34組MBD-3表達(dá)水平比較 結(jié)果顯示，非哮喘感染組和哮喘感染治療組MBD-3均高表達(dá)，兩組的MBD-3表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=1.789，P>0.05)；哮喘感染組MBD-3的表達(dá)水平低于非哮喘感染組(q=60.823，P<0.05)和哮喘感染治療組(q=59.034，P<0.05)，見圖3A、B。4組MBD-3的mRNA水平比較，哮喘感染組低于非哮喘感染組(q=28.623，P<0.05)和哮喘感染治療組(q=26.834，P<0.05)，哮喘感染治療組和非哮喘感染組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=1.789，P>0.05)，見圖3C。

3 討 論

過敏性哮喘是我國(guó)常見的一種復(fù)雜的慢性炎癥性氣道疾病。氣道總是暴露在微生物環(huán)境中，氣道感染是最常見的疾病。以往研究表明，過敏性氣道炎癥能抑制氣道抗菌宿主防御反應(yīng)，同時(shí)，氣道感染和細(xì)菌定植在難治性哮喘中發(fā)揮重要作用[9]。銅綠假單胞菌感染是慢性肺部感染的危險(xiǎn)因素，也是患者肺部感染發(fā)病率和病死率的主要決定因素[10]。

ASIT是世界衛(wèi)生組織認(rèn)可的治療過敏性哮喘的唯一有效方法[11]。其中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)是哮喘患者ASIT的重要免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，Treg數(shù)量不足和(或)功能低下是發(fā)生塵螨過敏性哮喘的重要因素。Treg能夠直接抑制Th2反應(yīng)和肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的活化。采用塵螨疫苗免疫治療的ASIT可抑制加重的Th2型免疫反應(yīng)，并上調(diào)Treg的數(shù)量和功能，從而減輕或緩解哮喘的嚴(yán)重程度[12]。然而，塵螨疫苗免疫治療能否影響哮喘患者的抗微生物宿主防御反應(yīng)仍不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，銅綠假單胞菌感染哮喘小鼠的肺部炎癥明顯比銅綠假單胞菌感染正常小鼠嚴(yán)重，其細(xì)菌載量也顯著高于銅綠假單胞菌感染正常小鼠。然而，采用塵螨疫苗免疫治療時(shí)，銅綠假單胞菌感染哮喘小鼠的肺部炎癥明顯減輕，并且銅綠假單胞菌載量顯著降低。因此，本研究結(jié)果提示，銅綠假單胞菌感染加重了哮喘小鼠的肺部炎癥，而塵螨疫苗免疫治療能夠增強(qiáng)哮喘小鼠的抗微生物宿主防御反應(yīng)。

先天性免疫是機(jī)體發(fā)育和進(jìn)化過程中形成的自然免疫防御系統(tǒng)，是宿主抵御微生物入侵的第一道防線，由固有免疫屏障、固有免疫細(xì)胞和固有免疫分子組成[13]。AMP是重要的固有免疫分子，具有廣譜殺菌作用，包括防御素和cathelicidins兩大主要的AMP家族。防御素是一個(gè)重要的內(nèi)源性AMP家族，能夠快速、非特異性地殺死入侵的病原體[14]。作為先天性免疫的多功能效應(yīng)分子，防御素是固有免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵成分，在體外可殺死或抑制細(xì)菌、真菌和包膜病毒等大多數(shù)微生物[15]。人β防御素2(HBD-2)是氣道先天性免疫的主要成分，是第一個(gè)由炎癥和細(xì)胞因子誘導(dǎo)表達(dá)的人防御素。HBD-2在皮膚、黏膜和氣道黏膜的抗感染免疫中起重要作用[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，哮喘感染組小鼠MBD-3(HBD-2的同源物)的表達(dá)水平顯著低于非哮喘感染組小鼠；在接受塵螨疫苗免疫治療后，哮喘感染組小鼠MBD-3的表達(dá)上調(diào)，與非哮喘感染組小鼠比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，本研究結(jié)果提示，銅綠假單胞菌感染能抑制哮喘MBD-3的表達(dá)，而塵螨疫苗免疫治療能夠上調(diào)哮喘小鼠氣道中被抑制的MBD-3的表達(dá)。

4 結(jié) 論

本研究表明，塵螨疫苗免疫治療可能通過上調(diào)MBD-3的表達(dá)，來降低哮喘小鼠氣道銅綠假單胞菌感染的嚴(yán)重程度；這些發(fā)現(xiàn)提示，除上調(diào)宿主特異性免疫應(yīng)答外，塵螨疫苗免疫治療還可能增強(qiáng)哮喘小鼠氣道抗菌宿主防御反應(yīng)。