侯克洪 馮 瀟 高成成 湯曉智

(南京財經(jīng)大學食品科學與工程學院；江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心；江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點實驗室，南京 210023)

植物精油是從植物的花、葉、莖、根或果實中提取的含有揮發(fā)性芳香物質(zhì)的濃縮親脂液體，其中的活性成分抗菌性強，是良好的天然抗菌劑[1]。然而，精油的強揮發(fā)性和疏水性以及其對環(huán)境如氧氣、光、穩(wěn)定的高敏感性限制了精油在食品領域的應用。

利用納米乳液包埋精油并應用于食品的抗菌保鮮已經(jīng)有大量的報道[2-4]。納米乳液載體的運載效應使被包埋的脂溶性成分的水溶解度顯著提高，而且穩(wěn)定性也有所提高。此外，由于液滴尺寸較小，顆粒光散射波較弱，使乳液呈現(xiàn)透明或僅輕度混濁狀態(tài)，在飲料或某些食品中添加時不改變其光學性質(zhì)[5]。然而，油水兩相界面間較高的正自由能決定了納米乳液是一種熱力學不穩(wěn)定性的體系，并可能因重力分離、凝聚、聚集、奧氏熟化等作用而發(fā)生破乳現(xiàn)象，因此如何制備具有較好穩(wěn)定性的納米乳液是目前研究的熱點。改善納米乳液的穩(wěn)定性可通過控制其油/水相組成、粒徑分布以及加入穩(wěn)定劑，如乳化劑、品質(zhì)改良劑或緩凝劑等實現(xiàn)[6]。

酪蛋白酸鈉是常用的天然高分子乳化劑。酪蛋白酸鈉已被報道可以降低界面張力，并且相對于球蛋白如乳清蛋白在界面處更易于展開，從而起到穩(wěn)定乳液的效果[7-8]。羥丙基-β-環(huán)糊精(HPCD)是β-環(huán)糊精(β-CD)的醚化衍生物。羥丙基的引入部分打開了β-CD的分子內(nèi)氫鍵，水溶性大大提高(>500 g/L，20 ℃)。與β-CD母體相比，HPCD在提高包埋物的溶解度、溶出速度、生物利用度和穩(wěn)定性方面都有獨特的作用，是目前研究及應用最為廣泛的β-CD衍生物[9]。HPCD具有較β-CD更高的安全性，被認為是很有潛力的母體環(huán)糊精替代品[10]。然而，研究者往往更多關注其包合特性，反而忽略了其非包合方面的特性，比如其類似于表面活性劑的親疏水特性[11]。由于HPCD 具有親脂的內(nèi)部空間和親水的外部空間，可以將其理解為一個特殊的表面活性劑，水不溶性的精油可以進入親脂的內(nèi)部空間，與HPCD 形成水溶性復合體，從而增強乳液的穩(wěn)定性。因此，本研究使用HPCD與酪蛋白酸鈉共同乳化制備肉桂精油納米乳液，研究HPCD和酪蛋白酸鈉的添加量對乳液粒徑的影響，并在此基礎上，探究不同精油添加量下乳液的穩(wěn)定性和抑菌性能，旨在為制備高穩(wěn)定性且具備良好抑菌性能的精油納米乳液提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肉桂精油，食品級；羥丙基-β-環(huán)糊精，純度97%；酪蛋白酸鈉，食品級；尼羅紅，純度≥95%。

1.2 儀器與設備

ULTRA-TURRAX T18高速分散器；SCIENTZ-1500F 超聲波分散儀；Nano-ZS90 納米激光粒度儀；AxioScopeA1熒光顯微鏡；HWS型恒溫恒濕箱；GHP-250智能光照培養(yǎng)箱； SpectralMax-M2e酶標儀。

1.3 方法

1.3.1 乳液的制備

室溫下將HPCD溶解于純水中，再添加酪蛋白酸鈉充分溶解后，逐滴加入肉桂精油，繼續(xù)攪拌2 h，高速分散器18 000 r/min條件下處理5 min，最后在450 W功率下，超聲處理10 min。其中酪蛋白酸鈉的質(zhì)量分數(shù)為0.5%、1.0%、1.5%(m/m)，肉桂精油的體積分數(shù)為1%、3%、6%、10%(V/V)，HPCD的質(zhì)量分數(shù)選擇前期實驗中效果最好的3%(m/m)。

1.3.2 平均粒徑和多分散指數(shù)(PDI)分析

用納米激光粒度儀測量乳液平均粒徑和PDI。使用去離子水以1∶100稀釋樣品并充分攪拌以避免多次散射效應，根據(jù)米氏散射理論，選擇折射率為1.456和吸收系數(shù)為0.001。

1.3.3 抗菌活性

參考Moraes-Lovison等[12]的方法，稍作修改，研究乳液對大腸桿菌(Escherichiacoli，E.coli)和金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus，S.aureus)的抗菌活性。使用LB肉湯，接種微生物后置于恒溫振蕩箱中，150 r/min、37 ℃下培養(yǎng)24 h，將菌濃度稀釋至108CFU/mL。取1 mL稀釋好的菌液與8.5 mL營養(yǎng)肉湯和0.5 mL樣品乳液(對照組為0.5 mL無菌水，其他操作相同)，混合振蕩30 s，然后37 ℃下培養(yǎng)。每隔一段時間，通過平板計數(shù)法測定混合液的菌濃度。

1.3.4 最小抑菌濃度和最小殺菌濃度

參考Rakmai等[13]的方法，通過微量稀釋法測定最小抑制濃度。將微生物濃度稀釋至約為105CFU/mL備用，取0.5 mL的每種細菌接種物接種2.5 mL營養(yǎng)肉湯。然后將不同體積分數(shù)的精油(溶于10%的乙醇溶液)或納米乳液加入管中，旋渦攪拌30 s。將混合液在37 ℃下培養(yǎng)24 h后未觀察到可見微生物生長(OD600變化≤0.05)的最低濃度為精油和納米乳液的最小抑菌濃度(MIC)。將在OD600下顯示無濁度的培養(yǎng)液中的測試微生物培養(yǎng)液轉移100 μL并涂布在PCA營養(yǎng)瓊脂上，37 ℃培養(yǎng)24 h，不生長微生物的對應濃度作為最小殺菌濃度(MBC)。

1.3.5 儲藏穩(wěn)定性

將新鮮制備的乳液分別放在4、25、40 ℃環(huán)境下，儲存28 d，每隔7 d測量粒徑，進行拍照和熒光顯微鏡觀察。

1.3.6 乳化指數(shù)

乳化指數(shù)間接表明了乳液的穩(wěn)定性。參考Cheong等[14]的方法，乳液制備完成后，立即將10 mL納米乳液轉移到試管中密封，然后分別在4、25、40 ℃下儲存。乳化指數(shù)通過公式測定：

乳化指數(shù)=(HL/HE)×100%

式中：HL為奶油層的高度；HE為乳劑的總高度。

1.3.7 熒光顯微鏡

用適量尼羅紅溶液(0.1 mg/mL，溶于乙醇)對乳液預先染色，在熒光顯微鏡下觀察被染色的油滴形態(tài)大小，記錄圖像。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS 22軟件對數(shù)據(jù)進行處理，數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。采用單因素方差分析分析組間差異性，以P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 粒度和電位測量

表1顯示了質(zhì)量分數(shù)為0.5%、1.0%、1.5%酪蛋白酸鈉(SC)單獨或與HPCD共同作用下不同肉桂精油含量的乳液粒徑和PDI。由表1可知，酪蛋白酸鈉可以用于穩(wěn)定肉桂精油納米乳液，當使用0.5%的酪蛋白酸鈉時，乳液粒徑范圍在226.93～350.10 nm，PDI范圍在0.20～0.31，但粒徑和PDI隨著精油濃度的增加而增加。表明在較低SC濃度下，隨著精油濃度增加，沒有足夠的SC分子完全覆蓋乳液液滴，乳液由于聚結而不穩(wěn)定，其粒徑和PDI有所增加[11]。當酪蛋白酸鈉使用量由0.5%增加到1.0%時，可以看到在較低精油濃度時粒徑無顯著變化，但當精油體積分數(shù)增加到10%(V/V), 相對于0.5%的酪蛋白酸鈉，1.0%酪蛋白酸鈉穩(wěn)定的精油乳液粒徑顯著降低。當繼續(xù)增加酪蛋白酸鈉到1.5%，乳液粒徑反而有所上升。因為酪蛋白酸鈉是一種柔性蛋白，通過降低界面張力，并在油水界面處展開來穩(wěn)定乳液，當濃度過高時，酪蛋白酸鈉分子游離在溶液中，無法吸附到界面處起到穩(wěn)定乳液的作用，反而使乳液的粒徑增加[7]。

表1 不同SC濃度時不添加或添加HPCD乳液的粒徑和PDI

HPCD的添加可以顯著降低酪蛋白酸鈉-精油乳液的粒徑及PDI值，相較僅使用1%酪蛋白酸鈉穩(wěn)定的乳液粒徑，當使用1%酪蛋白酸鈉和3%HPCD共同穩(wěn)定乳液時粒徑降低到198.57～233.93 nm。其可能原因在于HPCD對精油的包合特性抑制了精油的聚集[13,15-16]。此外，HPCD包合精油生成的復合物，可能通過吸附在油滴表面增強其乳化穩(wěn)定性，起到輔助其他乳化劑降低乳液粒徑穩(wěn)定乳液的效果。

2.2 抑菌生長曲線

1%酪蛋白酸鈉和3%HPCD共同穩(wěn)定的肉桂精油納米乳液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌曲線如圖1所示。與對照組相比，添加納米乳液后，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長受到明顯抑制，并且隨著精油添加量的增加，乳液對微生物的抑制作用也逐漸增強。精油納米乳液的抑菌主要取決于基質(zhì)中精油的濃度、粒徑以及乳液中精油的釋放速度。當乳液添加進營養(yǎng)基質(zhì)中，由于水包油乳液的水溶性與分散性良好，納米級粒徑的精油液滴呈現(xiàn)較高的比表面積，增大了與微生物的接觸機會，因此當與生物系統(tǒng)相互作用時呈現(xiàn)增強抑制的功能[17]。并且隨著時間的推移精油從納米乳液中持續(xù)釋放，延長了精油作用于微生物的時間。當精油添加量為10%時，可以看到大腸桿菌的濃度降低了2.62 lg(CFU/mL)，金黃色葡萄球菌的濃度降低了0.85 lg(CFU/mL)，并在72 h內(nèi)保持殺菌效果。

圖1 乳液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌生長曲線

肉桂精油納米乳液對大腸桿菌的抑制作用強于金黃色葡萄球菌。革蘭氏陰性菌比革蘭氏陽性菌更敏感，可能是因為革蘭氏陰性菌的外膜和內(nèi)膜都有精油主要成分(肉桂醛)的靶位點，并且一旦外膜被破壞，細胞質(zhì)膜就容易接近并破壞，造成細胞質(zhì)外泄，從而達到更強殺菌效果[18]。

2.3 最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)

最小抑菌濃度(MIC)是指抗菌劑能抑制微生物生長的最低濃度，最小殺菌濃度(MBC)是指抗菌劑能殺死微生物的最低濃度，MIC和MBC都可以用來評價抗菌劑的抑菌和殺菌作用的強弱，其數(shù)值越小，代表抗菌劑的作用越強。如表2所示，與純?nèi)夤鹁拖啾?，肉桂精油納米乳液的MIC和MBC均降低，表明精油以納米乳液形式存在顯著增強了其抑菌性，也意味著可以適當調(diào)整精油的使用量達到同樣的抑菌效果，從而一定程度上降低精油特殊的風味對于食品體系的影響。精油納米乳液比純精油具有更好的水溶性、分散性以及更高的比表面積，增大了與微生物的接觸機會，此外，具有納米級別液滴的乳液有可能通過細菌外膜的孔蛋白進行轉運，從而提高精油的遞送效率并帶來更高的抗微生物活性[19-20]。

表2 肉桂精油、HPCD和肉桂精油乳液的MIC和MBC

2.4 貯藏穩(wěn)定性

4、25、40 ℃是食品加工貯藏中的幾個常用溫度。1%酪蛋白酸鈉和3%HPCD共同穩(wěn)定的肉桂精油納米乳液在4、25、40 ℃下貯藏28 d的粒徑變化如圖2所示。當精油添加量為1%、3%和6%時，乳液的粒徑在不同溫度下儲存均沒有明顯變化，表明在這些精油體積分數(shù)下納米乳液的穩(wěn)定性良好。當精油體積分數(shù)為10%時，在儲存的最初7 d內(nèi)，液滴的粒徑大小增加迅速，但7 d后，粒徑增長變緩，乳液趨于穩(wěn)定。這可能是因為在O/W乳液體系中形成液滴時，新形成液滴在制備過程中獲得過多的能量，可能需要一定時間達到熱力學平衡[21]。由于奧斯特瓦爾德熟化等作用，小液滴向大液滴靠攏并發(fā)生聚集，粒徑逐漸上升[22-23]。

2.5 乳化指數(shù)測定

乳化指數(shù)是表征乳液穩(wěn)定性的方法，高乳化指數(shù)表明乳液由于粒徑大、共軛、絮凝或聚集造成乳液不穩(wěn)定。如圖3所示，當精油添加量為1%和3%時，在4、25、40 ℃下28 d的儲存期間內(nèi)沒有產(chǎn)生乳化層，說明乳液的穩(wěn)定性良好，且一定范圍內(nèi)溫度對乳液的穩(wěn)定性無顯著影響。當精油添加量增加至6%和10%時，隨著儲存時間的增加乳化指數(shù)有所增加。且溫度越高，乳液的乳化指數(shù)增長越大，表明乳液的加工貯藏中溫度依然對其穩(wěn)定性有一定影響。

2.6 熒光顯微鏡

新鮮納米乳液和25 ℃下儲存28 d后納米乳液的熒光顯微鏡圖如圖4～圖5所示。新鮮制備的納米乳液呈現(xiàn)出非常微小且均勻分布的油滴，但仍能觀察到隨著精油添加量的增加，精油的分布更加密集，并且液滴大小有一定的增長，這與表2中的數(shù)據(jù)相符。對比新鮮乳液和儲存28 d的熒光圖，肉眼可見的乳液油滴粒徑有明顯的增長，這與儲藏過程粒徑的變化趨勢相一致。但從圖5中可見，乳液中油滴仍然是分布相對均勻的，包括肉桂精油體積分數(shù)為10%時，表明1%酪蛋白酸鈉和3%HPCD共同乳化的肉桂精油納米乳液具備良好的穩(wěn)定性。

注：a:1.0SC+3HPCD+1CEO;b:1.0SC+3HPCD+3CEO;c:1.0SC+3HPCD+6CEO;d:1.0SC+3HPCD+10CEO,下同。圖4 新鮮乳液熒光顯微圖

圖5 25 ℃下儲存28 d乳液熒光顯微圖

3 結論

與單獨使用酪蛋白酸鈉穩(wěn)定的乳液相比，HPCD與酪蛋白酸鈉共同穩(wěn)定的乳液具備更低的粒徑及PDI值；1%酪蛋白酸鈉和3%HPCD共同穩(wěn)定的肉桂精油納米乳液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出良好的抗菌作用，以及相比精油自身更低的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)。乳液在4、25、40 ℃下儲存過程中的粒徑、乳化指數(shù)、以及熒光顯微鏡圖均表明1%酪蛋白酸鈉和3%HPCD共同乳化的肉桂精油納米乳液具備良好的穩(wěn)定性。HPCD 具有親脂的內(nèi)部空間和親水的外部基團，水不溶性的精油可以進入親脂的內(nèi)部空間，與HPCD 形成水溶性復合體，從而起到抑制精油的聚集，輔助其他乳化劑降低乳液粒徑，增強乳液穩(wěn)定性的效果。