傅 鈺 張 禾 符 群,2

(東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院1，哈爾濱 150040) (黑龍江省森林食品資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2，哈爾濱 150040)

藜麥(ChenopodiumquinoaWilld.)是藜科藜屬植物，具有一定的耐旱、耐寒、耐鹽性，根據(jù)其種皮的顏色不同可分為白、紅、黑3種。藜麥中富含多種氨基酸、維生素、多酚類[1，2]、黃酮類、皂苷和植物甾醇類物質(zhì)，其所含脂肪中不飽和脂肪酸占83%[3]，具有多種健康功效，可以抗腫瘤[4，5]、抑菌、抗病毒[6，7]、抗氧化等[8，9]。藜麥在1980年被美國(guó)宇航局用于宇航員的太空食品。聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織認(rèn)為藜麥?zhǔn)俏ㄒ灰环N單體植物且可滿足人體基本營(yíng)養(yǎng)需求，正式推薦藜麥為最適宜人類的全營(yíng)養(yǎng)食品，因此藜麥也被國(guó)際營(yíng)養(yǎng)學(xué)家稱為“未來(lái)食品”“超級(jí)谷物”[10]。皂苷又稱為皂角苷，研究發(fā)現(xiàn)皂苷具有多種生理功效，如抑菌、降低膽固醇水平等，多種中藥的有效成分都為皂苷。藜麥麩皮中含有大量皂苷，質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)20%～30%[7]。藜麥皂苷水溶后會(huì)產(chǎn)生苦澀味，過(guò)高劑量服用會(huì)產(chǎn)生毒性，但由于其優(yōu)良特性，近年來(lái)成為醫(yī)學(xué)、食品等行業(yè)的熱點(diǎn)研究對(duì)象[11]。

目前，活性成分的提取方法以有機(jī)溶劑浸提為主，微波、超聲波等技術(shù)作為輔助提取。由于植物活性物質(zhì)具有多元酚羥基和一定的極性，因此在藜麥皂苷的提取中常選用水或乙醇、甲醇、丙酮等有機(jī)溶液作為提取劑，這一類溶劑具有較好的溶解性能，并且對(duì)植物細(xì)胞具有一定的穿透能力，可以促進(jìn)物質(zhì)的分離。有機(jī)溶劑萃取法成本低廉，設(shè)備結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，但提取效率往往比較低[12]。超聲波輔助提取是利用超聲波產(chǎn)生的空化效應(yīng)，使原料的微小顆粒發(fā)生收縮和崩裂，從而釋放出活性成分[13]。已有研究對(duì)不同顏色的藜麥之間的對(duì)比較少，且藜麥制品的原料選擇也鮮有關(guān)注。趙丹青等[14]對(duì)不同品種藜麥的主要營(yíng)養(yǎng)成分和礦物元素含量進(jìn)行分析，得到在不同顏色藜麥中，黑色藜麥中各類氨基酸含量均高于其他顏色的藜麥。因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)超聲波輔助乙醇提取法[15]，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上, 運(yùn)用響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對(duì)藜麥中的皂苷提取工藝進(jìn)行優(yōu)化, 確定最佳提取條件，并對(duì)3種藜麥中提取的皂苷進(jìn)行抗氧化劑效實(shí)驗(yàn), 為提取和評(píng)價(jià)藜麥中活性成分提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑、紅、白藜麥：2018年采集自青海省西寧市多巴鎮(zhèn)。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(≥98%)，2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)銨鹽，齊墩果酸(≥98%)；冰乙酸、無(wú)水乙醇、香草醛、鐵氰化鉀、三氯化鐵、過(guò)硫酸鉀等均為分析純。

T6紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，KQ-300DE數(shù)控超聲清洗器，EPOCH2全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀。

1.2 方法

1.2.1 原料處理

3種藜麥挑選去雜，低溫干燥至水分恒定，破碎為60目粉末，冷藏備用。以黑色藜麥為例，研究藜麥皂苷的提取工藝。

1.2.2 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制與皂苷含量測(cè)定

準(zhǔn)確稱量25 mg齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品，用乙醇配制成1 mg/mL的母液。分別取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL母液于7個(gè)10 mL試管中，置于70 ℃水浴揮干溶劑。再加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL、高氯酸0.8 mL，在60 ℃水浴下反應(yīng)15 min，取出后用冷水冷卻，加入5.00 mL冰醋酸并在暗處反應(yīng)15 min。以無(wú)標(biāo)準(zhǔn)品的空白樣為對(duì)照，在550 nm處測(cè)定吸光值，以齊墩果酸質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)(X)，吸光值為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[16]。得到線性回歸方程：Y=1.516 67X+0.016 67，R2=0.999 7。

對(duì)提取液按照該方法測(cè)定皂苷含量，將測(cè)得的吸光度值代入回歸方程中得到皂苷濃度，并按照式(1)計(jì)算提取液中皂苷提取量。

(1)

式中：c為提取液中皂苷的濃度/mg/mL；V為提取液定容體積/mL；M為藜麥粉質(zhì)量/g。

1.2.3 超聲波輔助乙醇提取藜麥皂苷的工藝研究

準(zhǔn)確稱取1.000 g黑藜麥粉，以黑色藜麥中皂苷提取量為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，在300 W超聲功率下，分別考察液料比(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1 mL/g)，提取時(shí)間(20、30、40、50、60 min)，提取溫度(30、40、50、60、70 ℃)，乙醇體積分?jǐn)?shù)(50%、60%、70%、80%、90%、100%)對(duì)皂苷提取量的影響。

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采取Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，利用Design-Expert設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，對(duì)超聲波輔助提取藜麥中皂苷的工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.4 藜麥提取物的抗氧化活性研究

1.2.4.1 DPPH·自由基清除率測(cè)定

在96孔板中依次加入不同濃度梯度的樣液100 μL和0.2 mol/L DPPH·溶液100 μL，充分混勻，避光反應(yīng)30 min后于517 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值A(chǔ)i。用100 μL無(wú)水乙醇代替DPPH·溶液，測(cè)定吸光度值A(chǔ)j。用100 μL無(wú)水乙醇代替不同濃度梯度的皂苷提取液，測(cè)定吸光度值A(chǔ)0。根據(jù)式(2)計(jì)算活性物質(zhì)對(duì)DPPH·清除率[17]。

(2)

式中：Ai為樣品液的吸光度值；Aj為樣品空白管的吸光度值；A0為空白對(duì)照管的吸光度值。

1.2.4.2 ABTS+·自由基清除率測(cè)定

將7.4 mmol/LABTS+·溶液與2.6 mmol/L過(guò)硫酸鉀溶液按體積比1∶1混合，室溫避光靜置12～16 h，用乙醇稀釋至在734 nm處吸光度值為0.7±0.02，備用。在96孔板中依次加入25 μL不同濃度梯度的皂苷提取液，200 μL ABTS+·溶液，避光靜置6 min，在734 nm處測(cè)吸光度值，得到A1。用25 μL乙醇代替樣液，測(cè)定吸光度值，得到A0。用200 μL乙醇代替ABTS+·溶液，測(cè)定吸光度值，得到A2。根據(jù)式(3)計(jì)算活性物質(zhì)對(duì)ABTS+·清除率[17]。

(3)

式中：A0為空白對(duì)照吸光度值；A1為樣液吸光度值；A2為樣液空白管吸光度值。

1.2.4.3 總還原力的測(cè)定

取不同濃度梯度的皂苷溶液0.1 mL于試管中，并加入1.00 mL抗壞血酸、2.5 mL磷酸鹽緩沖液和鐵氰化鉀溶液，將試管置于50 ℃水浴中反應(yīng)20 min，取出后迅速冷卻至室溫，再加入2.5 mL三氯乙酸。將混合溶液轉(zhuǎn)移至離心管中，在4 000 r/min的條件下離心10 min。取上清液2.5 mL于試管中，加入2.5 mL蒸餾水和1.00 mL三氯化鐵，混合均勻后，在700 nm下測(cè)量溶液的吸光值，以無(wú)水乙醇調(diào)零[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

由圖1可見(jiàn)，隨著液料比、提取時(shí)間、提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，皂苷提取量總體呈先上升后下降的趨勢(shì)，其中乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)皂苷提取量的影響最為顯著。這可能是由于隨著液料比和提取時(shí)間的增加，固體原料與溶液的接觸面積增加且反應(yīng)時(shí)間加長(zhǎng)，使皂苷更充分地溶解于乙醇溶液中，但當(dāng)液料比增大到一定比例后，其對(duì)接觸面積的影響將不再明顯，且時(shí)間繼續(xù)增加可能會(huì)融入其他的雜質(zhì)干擾了皂苷的溶出，并且破壞皂苷成分，從而使皂苷的提取量下降；提取溫度升高會(huì)使分子的擴(kuò)散速度快，皂苷分子溶解在乙醇溶液中的能力變強(qiáng)，當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)，可能會(huì)引起溶劑的揮發(fā)過(guò)大，并且伴隨著較多雜質(zhì)物質(zhì)的溶出，從而導(dǎo)致皂苷提取量的下降；而體積分?jǐn)?shù)的增加，乙醇提取液的極性與被提取溶質(zhì)的極性逐漸接近，根據(jù)相似相溶的原理，更多的皂苷溶解在乙醇提取液中，但當(dāng)體積分?jǐn)?shù)增大到100%時(shí)被提取溶質(zhì)的極性會(huì)小于提取液的極性，且其他雜質(zhì)的溶出量會(huì)增加，從而導(dǎo)致了藜麥皂苷提取量的減小。

圖1 不同單因素對(duì)皂苷提取量的影響

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

2.2.1 響應(yīng)面結(jié)果與方差分析

根據(jù)單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以黑色藜麥中皂苷提取量為響應(yīng)值，以提取時(shí)間、提取溫度、液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)為自變量，進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，經(jīng) Design-Expert 8.0.6 trial 設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果如表1所示。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 方差分析表

2.2.2 響應(yīng)曲面與等高線分析

藜麥皂苷提取量的影響因素及其交互作用的顯著性如圖2～圖7所示。通過(guò)等高線的形狀分析交互影響的顯著程，響應(yīng)面上標(biāo)記的最高點(diǎn)即為最大值，說(shuō)明在所選分析的因素水平范圍內(nèi)存在極值[19]。由圖2～圖7可知，提取時(shí)間、提取溫度、液料比和體積分?jǐn)?shù)對(duì)皂苷提取量均有顯著影響。圖2表明當(dāng)溫度一定時(shí)，隨著提取時(shí)間的增加，皂苷的提取量增大，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到50 min時(shí)提取量最高，繼續(xù)增加提取時(shí)間其提取量會(huì)發(fā)生下降；當(dāng)提取時(shí)間一定時(shí)，提取溫度有相同的趨勢(shì)，但影響較?。浑S著提取溫度的增大，皂苷的提取量先增大后減小。圖3和圖4表示隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，藜麥皂苷的提取量先增大后減小，在90%時(shí)取得最大值；液料比和提取時(shí)間對(duì)提取量均有相同的影響趨勢(shì)，但效果小于體積分?jǐn)?shù)。圖5表明當(dāng)液料比一定時(shí)，提取溫度增大會(huì)使皂苷的提取量先增大后減小，在60 ℃時(shí)達(dá)到最大值；溫度一定時(shí)，液料比對(duì)提取量有相同的影響趨勢(shì)。圖6表明體積分?jǐn)?shù)和提取溫度的增大都會(huì)使皂苷提取量先增大后減小，分別在90%和60 ℃時(shí)取得最高點(diǎn)。圖7表明體積分?jǐn)?shù)和液料比對(duì)皂苷的提取量影響效果相同，提取量隨著體積分?jǐn)?shù)和液料比的增大而先升高后下降，在90%和50∶1 mL/g時(shí)達(dá)最大值。

圖2 提取時(shí)間及提取溫度對(duì)皂苷提取量的等高線及響應(yīng)面

圖3 提取時(shí)間及液料比對(duì)皂苷提取量的等高線及響應(yīng)面

圖4 提取時(shí)間及乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)皂苷提取量的等高線及響應(yīng)面

圖5 提取溫度及液料比對(duì)皂苷提取量的等高線及響應(yīng)面

圖6 提取溫度及乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)皂苷提取量的等高線及響應(yīng)面

圖7 液料比及乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)皂苷提取量的等高線及響應(yīng)面

2.2.3 最佳條件確定和回歸模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)響應(yīng)面分析得到超聲波輔助乙醇提取藜麥中皂苷的最佳工藝條件為：提取時(shí)間51.29 min，提取溫度59.74 ℃，液料比50.02∶1 mL/g，乙醇體積分?jǐn)?shù)90.57%，在此條件下皂苷提取量為12.717 5 mg/g。為使實(shí)際操作中更便于控制，調(diào)整最佳工藝為：提取時(shí)間50 min，提取溫度60 ℃，液料比50∶1 mL/g，乙醇體積分?jǐn)?shù)90%。在此條件下進(jìn)行最優(yōu)工藝的驗(yàn)證，計(jì)算出皂苷提取量為12.65 mg/g，實(shí)際得率與模型預(yù)測(cè)值的誤差為0.5%，證明模型理論預(yù)測(cè)值與實(shí)際值擬合效果良好。

采用相同方法對(duì)白色、紅色藜麥皂苷提取工藝進(jìn)行研究，因素優(yōu)化后的水平結(jié)果與黑色藜麥無(wú)顯著差異。

2.2.4 3種不同顏色的藜麥的抗氧化能力評(píng)價(jià)

2.2.4.1 DPPH·自由基清除能力

黑、白、紅3種顏色藜麥中的皂苷對(duì)DPPH· 的清除能力如圖8。隨著3種藜麥皂苷濃度增加，其清除DPPH·自由基的能力均呈現(xiàn)顯著增加趨勢(shì)，當(dāng)濃度達(dá)到10 mg/g時(shí)，3種藜麥的清除能力集中在較小的范圍內(nèi)；當(dāng)濃度較低時(shí)，3種不同品種的藜麥在其相同皂苷濃度條件下對(duì)DPPH·自由基的清除能力差異較大。黑色、紅色、白色藜麥皂苷的IC50分別為2.205、3.724、4.303 mg/g?？傮w趨勢(shì)表現(xiàn)為黑色藜麥>紅色藜麥>白色藜麥，即隨著其種皮顏色的由深至淺，抗氧化能力逐漸減弱。這可能是由于不同顏色的藜麥中含有的有效抗氧化皂苷量差異較大，其中深色藜麥含有較多且活性高，導(dǎo)致抗氧化能力更強(qiáng)。

圖8 不同藜麥皂苷對(duì)DPPH·自由基清除的影響

2.2.4.2 ABTS+·自由基清除能力

黑、白、紅3種顏色藜麥中的皂苷對(duì)ABTS+·清除能力結(jié)果如圖9。隨著皂苷濃度的增加，藜麥皂苷對(duì)ABTS+·自由基的清除能力也在逐漸增強(qiáng)。當(dāng)皂苷濃度達(dá)到10 mg/g時(shí)，黑、紅、白三色藜麥皂苷清除率差異顯著(P<0.05)，說(shuō)明不同品種的藜麥中皂苷種類可能有所不同，因此在清除ABTS+·自由基時(shí)表現(xiàn)出了不同的能力大小。在皂苷濃度較低時(shí)，紅色和白色藜麥清除能力相近，仍顯著小于黑色藜麥。3個(gè)品種的藜麥對(duì)ABTS+·自由基的清除能力大小為：黑色藜麥>紅色藜麥>白色藜麥。

圖9 不同藜麥皂苷對(duì)ABTS+·自由基清除的影響

2.2.4.3 總還原力

黑、白、紅3種顏色藜麥中的皂苷總還原能力對(duì)比結(jié)果見(jiàn)圖10。總還原力的強(qiáng)弱與吸光值的大小成正比。由圖10可知，3個(gè)不同品種藜麥皂苷的總還原力隨著皂苷濃度的增大而逐漸增強(qiáng)，其中黑色藜麥的還原能力極顯著大于紅色藜麥和白色藜麥(P<0.01)，而白色藜麥略大于紅色藜麥。已有研究證明，皂苷類化合物的抗氧化活性與皂苷元配基的結(jié)構(gòu)和糖殘基的數(shù)量有關(guān)[20]，因此可能是由于黑色藜麥與其他兩色的糖基不同導(dǎo)致活性差異顯著。

圖10 不同藜麥皂苷總還原能力對(duì)比

3 結(jié)論

采用超聲波輔助乙醇提取藜麥中皂苷化合物，單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，4個(gè)因素對(duì)皂苷的提取量影響趨勢(shì)相似，即先增大后減小。通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化出最佳工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)90%，液料比為50∶1 mL/g，超聲功率300 W，提取溫度60 ℃，提取時(shí)間50 min，此時(shí)皂苷的提取量為12.65 mg/g，結(jié)合響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)可得出4個(gè)因素對(duì)提取量的影響顯著程度為：提取時(shí)間>體積分?jǐn)?shù)>提取溫度>液料比。

對(duì)比了黑、紅、白3種藜麥皂苷的抗氧化能力強(qiáng)弱，結(jié)果表明，在對(duì)DPPH·、ABTS+·自由基的清除能力方面表現(xiàn)為：黑色藜麥>紅色藜麥>白色藜麥；在總還原能力方面表現(xiàn)為：黑色藜麥>白色藜麥>紅色藜麥。藜麥皂苷具有良好的抗氧化能力，且由于品種的不同其抗氧化能力也有所差異，整體上表現(xiàn)為深色藜麥皂苷活性優(yōu)于淺色藜麥皂苷，其中黑色藜麥的抗氧化能力最強(qiáng)。本研究體現(xiàn)出顯著的皂苷與抗氧化活性間劑量-效應(yīng)關(guān)系。藜麥提取物為混合物，今后研究可對(duì)提取物的成分進(jìn)行鑒定，以充分確證和評(píng)價(jià)藜麥皂苷活性。

不同顏色的藜麥之間存在一定程度的品質(zhì)差異，在口感方面，淺色藜麥優(yōu)于深色藜麥；但在抗氧化能力方面，黑色藜麥的抗氧化能力顯著高于紅色和白色藜麥。因此，在食品加工生產(chǎn)中可根據(jù)不同產(chǎn)品需求選擇不同顏色的藜麥原料。