莫志洋 李英 韓曉東 王虹霞 翁巧鳳

青海省人民醫(yī)院1頜面整形外科，2麻醉科（西寧810008）；3青海大學(xué)附屬醫(yī)學(xué)院口腔科（西寧810001）

舌鱗狀細(xì)胞癌（tongue squamous cell carcinoma，TSCC）是常見的口腔惡性腫瘤，發(fā)病率、病死率均較高［1-2］。上皮?間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）是腫瘤轉(zhuǎn)移、侵襲的起始步驟，與口腔鱗癌、喉癌、乳腺癌等惡性腫瘤發(fā)展過程密切相關(guān)［3-5］。淫羊藿次苷Ⅱ（icariside Ⅱ，ICSⅡ）是中藥淫羊藿主要提取物，可增強(qiáng)免疫功能、延緩衰老、調(diào)節(jié)骨代謝，抗腫瘤作用顯著。目前，臨床對ICS Ⅱ的探索多圍繞骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨性分化、腫瘤細(xì)胞增殖等方面［6-7］，鮮有關(guān)于其對TSCC EMT作用的研究。近年來有研究表明［8-9］，Notch1/PTEN/FAK信號傳導(dǎo)途徑的異常激活是腫瘤形成機(jī)制之一，且參與調(diào)節(jié)多種組織細(xì)胞的生長、分化、凋亡，但關(guān)于該通路在TCSS EMT中的作用研究尚少。鑒于此，本研究將探討ICSⅡ?qū)SCC細(xì)胞EMT影響，并探究其通過Notch1/PTEN/FAK通路的調(diào)控機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞TSCC細(xì)胞Tca?8113，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫。

1.1.2 藥物、主要試劑、主要儀器淫羊藿次苷Ⅱ（上海純優(yōu)生物科技有限公司，純度＞98%），胎牛血清、RPMI?1640培養(yǎng)基（美國Amresco公司），四氮唑鹽（microculture tetrozolium，MTT）溶液、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（美國Sigma公司），吉姆薩（Giemsa）染色液（南京億迅生物科技有限公司），BCA蛋白定量試劑盒（日本Takara公司），兔抗人Notch1、PTEN、FAK、磷酸化FAK（p?FAK）單抗（美國Abcam公司），辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗（上海合星生物科技有限公司）。

NIB900?FL型倒置熒光顯微鏡（德國Leica公司），SpectraMax iD3酶聯(lián)免疫檢測儀（美谷分子儀器（上海）有限公司），Transwell小室（北京優(yōu)尼康生物科技有限公司），TY?80電泳儀（南京普陽科學(xué)儀器研究所），F(xiàn)luor Chem FC2凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio?rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、干預(yù)RPMI?1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清），37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)Tca?8113細(xì)胞，隔天換液，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，待貼壁80%左右，胰酶消化調(diào)整密度傳代。取對數(shù)期細(xì)胞分裝至96孔板，200 μL/孔，設(shè)為空白組，ICS Ⅱ低、中、高劑量組，每組5個(gè)復(fù)孔，至細(xì)胞再次貼壁80%左右，加入不同濃度ICS Ⅱ，使各孔終濃度分別為12.5、25、50 μmol/L，空白組加入等量PBS處理，繼續(xù)常規(guī)條件培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞增殖抑制率測算MTT法：取各組干預(yù)24、48、72 h的Tca?8113細(xì)胞，棄去舊培養(yǎng)基后將新制備MTT溶液（濃度為5 μg/μL）滴入每孔中，20 μL/孔，于37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，棄去上層培養(yǎng)液，每孔加入DMSO溶液，100 μL/孔，充分震蕩30 min后采用酶聯(lián)免疫檢測儀測定570 nm處吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率（%）=（A空白組?A劑量組）/A空白組×100%。重復(fù)3次取均值。

1.2.3 細(xì)胞遷移能力測定劃痕試驗(yàn)：取各組干預(yù)48 h的Tca?8113細(xì)胞，胰酶消化，重懸，重新調(diào)整密度至2.0 × 104個(gè)/mL，接種于6孔板，孵育24 h待細(xì)胞鋪滿后棄去培養(yǎng)基。采用2 μL移液器槍頭沿單層細(xì)胞劃過，PBS輕吹去除細(xì)胞碎片，置入完全培養(yǎng)基繼續(xù)孵育24 h后。采用顯微鏡觀察，計(jì)算細(xì)胞遷移率（%）=（初始劃痕寬度—測量時(shí)劃痕寬度）/初始劃痕寬度×100%。

1.2.4 細(xì)胞侵襲能力測定Transwell小室試驗(yàn)：取各組干預(yù)48 h的Tca?8113細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2.0 × 105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，取200 μL接種于Transwell小室（24孔趨化板，孔徑8 μm）上室，下室中加入含10%胎牛血清培養(yǎng)基，孵育24 h擦去上室細(xì)胞，采用預(yù)冷PBS溶液沖洗，10%甲醛固定15 min，Giemsa染色后取少量懸液置于計(jì)數(shù)板中，顯微鏡觀察穿膜細(xì)胞數(shù)量。

1.2.5 細(xì)胞中Notch1、PTEN、FAK、p-FAK 蛋白相對表達(dá)量Western blot法：取各組干預(yù)72 h的TSCC細(xì)胞，冰上裂解，12 000 r/min離心15 min（離心半徑為8 cm），BCA試劑盒定量蛋白。取30 μg樣品與上樣緩沖液混合，凝膠電泳30 min，電轉(zhuǎn)45 min，加入5%脫脂奶粉封閉液封閉2 h，加入一抗（1∶1 000）于4 ℃孵育過夜，TBTS沖洗，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗（1∶10 000），常溫孵育2 h，TBTS沖洗。20 min內(nèi)曝光、顯影。采用凝膠成像系統(tǒng)掃描，以Notch1、PTEN、FAK、p?FAK蛋白灰度值/內(nèi)參β?actin灰度值表示蛋白相對表達(dá)量，計(jì)算p?FAK/FAK。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多樣本計(jì)量資料以方差分析檢驗(yàn)，以SNK?q檢驗(yàn)分析兩兩樣本。P ＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組增殖抑制率增殖抑制率組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；ICS Ⅱ低、中、高劑量組24、48、72 h增殖抑制率均呈上升趨勢（P ＜0.05）；隨時(shí)間延長各組增殖抑制率呈上升趨勢（P ＜0.05）。見表1。

表1 各組增殖抑制率Tab.1 Comparison of proliferation inhibition rate in each group ±s，%

表1 各組增殖抑制率Tab.1 Comparison of proliferation inhibition rate in each group ±s，%

注：與ICS Ⅱ低劑量組比較，aP ＜0.05；與ICS Ⅱ中劑量組比較，bP ＜0.05；與24 h 比較，cP ＜0.05；與48 h 比較，dP ＜0.05

組別ICSⅡ低劑量組ICSⅡ中劑量組ICSⅡ高劑量組F 值P 值24 h 17.45±2.17 20.35±3.84a 24.91±3.97ab 6.024 0.015 48 h 21.30±3.87c 26.02±3.95ac 31.63±4.01abc 8.597 0.005 72 h 27.61±3.90cd 32.76±4.29acd 38.71±5.01abcd 7.883 0.007

2.2 各組遷移能力空白組，ICSⅡ低、中、高劑量組遷移率分別為（86.14±9.11）%、（72.62±7.45）%、（60.91 ± 8.14）%、（33.86 ± 5.16）%，遷移率組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=42.669，P ＜0.001）；空白組大于ICSⅡ低、中、高劑量組（t=2.569，P=0.033；t = 4.618，P = 0.002；t = 11.166，P ＜0.001）；ICSⅡ低劑量組大于ICSⅡ中、高劑量組（t = 2.373，P =0.045；t = 9.564，P ＜0.001），ICSⅡ中劑量組大于ICSⅡ高劑量組（t=6.276，P ＜0.001）。見圖1。

圖1 劃痕試驗(yàn)結(jié)果（×100）Fig.1 Scratch test results（×100）

2.3 各組侵襲能力空白組，ICS Ⅱ低、中、高劑量組每個(gè)視野穿膜細(xì)胞數(shù)分別為（119.86 ± 27.09）、（98.74±18.92）、（40.30±7.35）、（19.10±4.27）個(gè)，穿膜細(xì)胞數(shù)組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F = 38.851，P ＜0.001）；空白組多于ICS Ⅱ低、中、高劑量組（t=2.469，P=0.039；t=6.338，P ＜0.001；t=8.216，

P ＜0.001）；ICS Ⅱ低劑量組多于ICS Ⅱ中、高劑量組（t=6.438，P ＜0.001；t=9.181，P ＜0.001），ICS Ⅱ中劑量組多于ICS Ⅱ高劑量組（t=5.577，P=0.001）。見圖2。

圖2 Transwell 小室試驗(yàn)結(jié)果（×100）Fig.2 Transwell chamber test results（×100）

2.4 各組Notch1、PTEN蛋白相對表達(dá)量及p-FAK/FAKNotch1、PTEN蛋白相對表達(dá)量及p?FAK/FAK比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；空白組，ICS Ⅱ低、中、高劑量組Notch1蛋白相對表達(dá)量及p?FAK/FAK呈降低趨勢（P ＜0.05），PTEN蛋白相對表達(dá)量呈升高趨勢（P ＜0.05）。見表2、圖3。

3 討論

TSCC是起源于舌復(fù)層鱗狀上皮的頭頸部惡性腫瘤，惡性程度高、浸潤性強(qiáng)，病灶可浸潤口腔頜面部、頸部重要組織結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致血管破裂、疼痛、張口受限等［10］。目前手術(shù)切除、放療、化療等綜合療法治療TSCC可獲取一定效果，但遠(yuǎn)期生存率并不理想［11］。研究［12］認(rèn)為，腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及局部侵襲是其惡性特征的主要表現(xiàn)，且是導(dǎo)致TSCC預(yù)后不良的重要因素，而EMT是該過程中的重要環(huán)節(jié)。因此，抑制EMT是改善TSCC預(yù)后、延長其生存期限的關(guān)鍵。近年來，隨著對傳統(tǒng)中藥開發(fā)、應(yīng)用力度的逐漸加大，從天然植物中提取化合物治療腫瘤已成為臨床研究熱點(diǎn)。淫羊藿是小檗科淫羊藿屬多年生草本植物，具有促進(jìn)精液分泌、降壓、降糖、利尿、抗腫瘤、抗衰老及增強(qiáng)造血功能和免疫功能等功效［13］。ICSⅡ提取自淫羊藿，其抗腫瘤作用近年來備受關(guān)注。

表2 各組Notch1、PTEN 蛋白相對表達(dá)量及p?FAK/FAKTab.2 Comparison of relative expression of Notch1 and PTEN protein and p?FAK/FAK in each group ±s

表2 各組Notch1、PTEN 蛋白相對表達(dá)量及p?FAK/FAKTab.2 Comparison of relative expression of Notch1 and PTEN protein and p?FAK/FAK in each group ±s

注：與空白組比較，aP ＜0.05；與ICS Ⅱ低劑量組比較，bP ＜0.05；與ICS Ⅱ中劑量組比較，cP ＜0.05

組別空白組ICSⅡ低劑量組ICSⅡ中劑量組ICSⅡ高劑量組F 值P 值Notch1 0.85±0.08 0.69±0.07a 0.44±0.04ab 0.21±0.02abc 118.935＜0.001 PTEN 0.22±0.03 0.41±0.05a 0.68±0.07ab 0.80±0.08abc 93.367＜0.001 p?FAK/FAK 0.84±0.09 0.58±0.06a 0.37±0.04ab 0.15±0.02abc 126.764＜0.001

圖3 蛋白免疫印記圖Fig.3 Immuno?imprint of protein

本研究結(jié)果顯示，ICSⅡ低、中、高劑量組增殖抑制率依次升高；空白組、ICSⅡ低、中、高劑量組遷移率依次降低，每個(gè)視野穿膜細(xì)胞數(shù)依次減少，提示ICS Ⅱ可抑制TSCC細(xì)胞增殖，降低其遷移、侵襲能力，且呈劑量依賴。ICS Ⅱ?qū)僖蜣近S酮苷類化合物，可抑制骨質(zhì)疏松、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)，且在宮頸癌、肝癌中均表現(xiàn)出良好的抗腫瘤作用［14-15］。NI等［16］采用菌落形成、Transwell小室試驗(yàn)及遷移測定等方式發(fā)現(xiàn)，ICSⅡ可通過影響細(xì)胞內(nèi)能量代謝，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，降低其遷移、侵襲能力，與本研究結(jié)論相似，但本研究采用不同劑量ICSⅡ進(jìn)行研究，更具說服力。SONG等［17］在探究ICS?Ⅱ?qū)549、H1299細(xì)胞遷移能力的影響中發(fā)現(xiàn)，ICS?Ⅱ可抑制由炎癥因子誘導(dǎo)的EMT及癌細(xì)胞侵襲。本研究采用ICSⅡ干預(yù)TSCC細(xì)胞后，細(xì)胞增殖受到抑制，且遷移、侵襲能力降低，可能與其抑制該腫瘤EMT程序信號、調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)有關(guān)。

此外，本研究中，ICSⅡ低、中、高劑量組Notch1蛋白及p?FAK/FAK呈降低趨勢，PTEN蛋白呈升高趨勢，推測ICSⅡ可能通過調(diào)控Notch1/PTEN/FAK信號通路，抑制TSCC細(xì)胞EMT，且呈劑量依賴性。Notch1通路是廣泛參與細(xì)胞分化、發(fā)育、調(diào)控的重要信號途徑，在不同腫瘤中發(fā)揮促癌或抑癌作用，甚至在同一腫瘤的不同階段可發(fā)揮相反的生理作用［18-19］。LIU等［20］認(rèn)為，Notch1基因在TSCC中異常高表達(dá)，采用Notch通路抑制劑DAPT可抑制TSCC細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移。PTEN是最早發(fā)現(xiàn)的具有蛋白磷酸酶、脂質(zhì)磷酸酶雙重活性的抑癌基因，可通過多條通路調(diào)控腫瘤生物學(xué)行為［21］。Notch1基因可能通過負(fù)性調(diào)控PTEN參與TSCC疾病進(jìn)程。FAK是位于胞質(zhì)的酪氨酸蛋白激酶，可通過促使細(xì)胞增殖從而激發(fā)細(xì)胞侵襲性生長。PTEN可通過降低FAK酪氨酸磷酸化水平，減少肌動(dòng)蛋白纖維數(shù)量、減弱細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力，抑制腫瘤黏附性生長，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲［22］。本研究應(yīng)用不同濃度ICSⅡ干預(yù)TSCC細(xì)胞，可能通過抑制Notch1表達(dá)及FAK磷酸化，上調(diào)PTEN而影響腫瘤細(xì)胞生長，降低其遷移、侵襲能力。

綜上所述，ICSⅡ可抑制TSCC細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力，且呈明顯劑量依賴性，推測其可能通過下調(diào)Notch1表達(dá)、上調(diào)PTEN表達(dá)、抑制FAK磷酸化發(fā)揮抗TSCC作用。基于ICSⅡ、Notch1/PTEN/FAK通路在TSCC治療中的作用，不僅為TSCC藥物的研發(fā)提供了更多的方向與思路，還為ICSⅡ應(yīng)用于TSCC的控制提供了更多理論依據(jù)。然而，ICSⅡ?qū)otch1/PTEN/FAK信號傳導(dǎo)途徑下游信號分子的影響如何，以及作用于TSCC時(shí)是否存在其他調(diào)控機(jī)制尚未明確，這也將是下一步的研究方向。