劉曉蕾 張艷 禮海 王懿 周雪 陳菲

[摘要] 目的 分析參草通脈顆粒對慢性心力衰竭（CHF）大鼠抗心室重構(gòu)的作用機制。 方法 選取SPF級大鼠60只，隨機抽取10只大鼠作為正常組，其余50只大鼠制備CHF大鼠模型，造模死亡9只，將剩余41只，隨機分為模型組13只、參草通脈顆粒組14只、賴諾普利組14只。正常組和模型組大鼠不用藥，賴諾普利組和參草通脈顆粒組大鼠連續(xù)給藥42 d。采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和蛋白質(zhì)印跡（WB）法測定基質(zhì)金屬蛋白酶-1（MMP-1）和金屬蛋白酶組織抑制物-1（TIMP-1）的mRNA和蛋白表達(dá)。 結(jié)果 與模型組比較，參草通脈顆粒組和賴諾普利組MMP-1 mRNA和蛋白均降低，差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義（均P < 0.01）;與賴諾普利組比較，參草通脈顆粒組MMP-1 mRNA表達(dá)降低（P < 0.05），而MMP-1蛋白表達(dá)升高（P < 0.05）。與模型組比較，參草通脈顆粒組和賴諾普利組TIMP-1 mRNA和蛋白均增加，差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義（均P < 0.01）;與賴諾普利組比較，參草通脈顆粒組TIMP-1 mRNA和蛋白表達(dá)增加（P < 0.05）。 結(jié)論 參草通脈顆粒治療CHF大鼠效果顯著，具有抗心室重構(gòu)的作用。

[關(guān)鍵詞] 慢性心力衰竭;參草通脈顆粒;基質(zhì)金屬蛋白酶-1;金屬蛋白酶組織抑制物-1

[中圖分類號] R285.5? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）10（c）-0008-04

Effects of Shencao Tongmai Granules on the mechanism of anti-ventricular remodeling in rats with chronic heart failure

LIU Xiaolei1? ?ZHANG Yan2? ?LI Hai1? ?WANG Yi1? ?ZHOU Xue1? ?CHEN Fei1

1.Department of Medical， Shenyang Second Hospital of Traditional Chinese Medicine， Liaoning Province， Shenyang? ?110015， China; 2.Expert Consultation， Affiliated Hospital， Liaoning University of Traditional Chinese Medicine， Liaoning Province， Shenyang? ?110015， China

[Abstract] Objective To analyze the mechanism of Shencao Tongmai Granules on anti-ventricular remodeling in rats with chronic heart failure （CHF）. Methods A total of 60 SPF rats were selected and ten rats were randomly taken as normal group. The other 50 rats were used to prepare the CHF rat model. In the process of modeling， nine rats failed to survive and the remaining 41 rats were divided into the model group （13 rats）， the Shencao Tongmai Granules group （14 rats） and the Lisinopril group （14 rats） randomly. Rats in normal group and the model group were fed normally without drugs and rats in Lisinopril group? and Shencao Tongmai Granules group were given drugs consecutively for 42 d. Reverse transcription PCR （RT-PCR） and Western blot （WB） were adopted to determine the mRNA and protein expression of matrix metalloproteinase-1 （MMP-1） and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 （TIMP-1）. Results Compared with the model group， the mRNA and protein expressions of MMP-1 in the Shencao Tongmai Granules group and Lisinopril group were reduced， and the differences were highly statistically significant （all P < 0.01）. Compared with the Lisinopril group， the MMP-1 mRNA expression of the Shencao Tongmai Granules group was decreased （P < 0.05）， while MMP-1 protein expression was increased （P < 0.05）. Compared with the model group， the mRNA and protein expressions of TIMP-1 in the Shencao Tongmai Granules group and Lisinopril group both increased， and the differences were highly statistically significant （all P < 0.01）. Compared with the Lisinopril group， the mRNA and protein expressions of TIMP-1 in the Shencao Tongmai Granules group were increased （P < 0.05）. Conclusion Shencao Tongmai Granules have a significant therapeutic effect on treating rats with CHF and can promote the mechanism of anti-ventricular remodeling.

[Key words] Chronic Heart Failure; Shencao Tongmai Granules; Matrix metalloproteinase-1; Tissue inhibitor of metalloproteinase-1

慢性心力衰竭（CHF）是以舒縮功能障礙為主的嚴(yán)重的臨床綜合征[1]。長期應(yīng)用常規(guī)西藥治療可出現(xiàn)諸多不良反應(yīng)[2]。參草通脈顆粒是臨床應(yīng)用30余年治療CHF的經(jīng)驗方，通過多年的臨床觀察和試驗，參草通脈顆粒對CHF患者療效確切[3]。本實驗從基因和蛋白表達(dá)兩方面，分析參草通脈顆粒對CHF的療效機制和作用靶點，為臨床治療CHF提供可靠依據(jù)，現(xiàn)報道如下：

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取體重為300～350 g，15周齡，SPF級SD雄性大鼠60只[由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供，許可證號：SCXK（遼）2015-0001，合格證號：201703120]，本研究經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 藥物制備

賴諾普利片（規(guī)格：10 mg/片，批號：H20131015），由上海信誼萬象藥業(yè)生產(chǎn)。參草通脈顆粒組成：丹參、人參、黃芪、紅花、三七粉、益母草、茯苓、葶藶子（由本溪三藥有限公司生產(chǎn)，批號：遼藥制Z0901013），處方中的全部藥材均符合參照《中國藥典》[4]2010版有關(guān)規(guī)定。

1.3 實驗試劑和儀器

基質(zhì)金屬蛋白酶-1（MMP-1）、金屬蛋白酶組織抑制物-1（TIMP-1）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）試劑盒（XG-E1088，大連TaKaRa公司）;實時熒光定量PCR儀（A-2060-1，Bioneer公司）;PCR擴增儀（96G，Biometra公司）;全自動蛋白印跡（WB）分析儀（SW1022-ProfiBlot 48型，Bioneer公司）。

1.4 CHF大鼠動物模型制備

大鼠正常條件下適應(yīng)喂養(yǎng)7 d后，為全部動物編號后隨機抽取10只大鼠作為正常組，大鼠正常飼養(yǎng)。其余大鼠禁食不禁水12 h后，麻醉，氣管插管，連接呼吸機，消毒后在左側(cè)第3、4肋間橫向切開長1～2 cm，用縫合線結(jié)扎距離左冠脈前降支起始點2～3 mm處，心電圖提示胸導(dǎo)ST段和T波出現(xiàn)明顯異常，將心臟送回胸腔，用注射用青霉素鈉（哈藥集團(tuán)制藥總廠，批號：H23021439，規(guī)格：800 000 U/支）在手術(shù)切口處敷用，大鼠生命體征平穩(wěn)后，撤掉呼吸機。術(shù)后連續(xù)3 d應(yīng)用注射青霉素鈉300 000 IU，1次/d。正常飼養(yǎng)1周后，喂養(yǎng)飼料減少1/2;同時大鼠每天進(jìn)行1次力竭式游泳，連續(xù)4周。當(dāng)大鼠出現(xiàn)毛色無光澤、精神萎靡、一般狀態(tài)較差，經(jīng)超聲檢測左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）≤60%，判定為大鼠CHF造模成功[5]。

1.5 實驗分組與給藥

大鼠造模死亡9只，將剩余41只大鼠，按照體重大小依次排序編號，采用隨機數(shù)字表求余數(shù)法將其分為3組，分別是模型組13只、參草通脈顆粒組14只、賴諾普利組14只。正常組10只為正常喂養(yǎng)未手術(shù)造模的大鼠。正常組和模型組大鼠不用藥，灌胃生理鹽水10 mL/kg，1次/d。其余組大鼠用藥劑量，按人鼠劑量換算公式，藥品劑量（g/kg）=人口服劑量（g）×0.018/動物體重（kg）[6]，計算出賴諾普利組：1.5 mg生藥/（kg·d），參草通脈顆粒組：9.2 g生藥/（kg·d），兩組藥溶于3 mL蒸餾水中，進(jìn)行灌胃1次/d，各組連續(xù)給藥42 d。

1.6 實驗取材

大鼠麻醉、處死，取其心肌組織，每只大鼠心肌組織按照標(biāo)準(zhǔn)處理分成兩份，每份100 mg，放入液氮 -80℃條件下保存，用于逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和WB技術(shù)檢測MMP-1和TIMP-1含量。

1.7 RT-PCR試驗

①TRIzol法抽提總RNA;②測定RNA濃度和純度;③逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA;④進(jìn)行PCR擴增;⑤PCR擴增應(yīng)用ABI 7500擴增儀，PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性95℃，0.5 min，1個循環(huán);變性95℃，0.05 s，退火60℃，34 s，延伸95℃，0.15 s，共40個循環(huán)，終延伸60℃，1 min;⑥利用Prime 5.0軟件設(shè)計引物序列、擴增產(chǎn)物長度。引物序列一覽表見表1。

1.8 WB試驗

取出心肌組織100 mg，塊剪碎后，以12 000 r/min，離心半徑為8 cm下，離心5 min，吸取上清提取蛋白;測定蛋白濃度;蛋白變性;灌制濃縮膠和分離膠;電泳;轉(zhuǎn)印120 min，TTBS洗膜1次，封閉;一抗孵育：加入1∶400的一抗，置于20～25℃，2 h;二抗孵育：加入堿性磷酸酶標(biāo)記的1∶2000二抗，20～25℃，2 h;清洗;顯色;采用FlourChem V 2.0凝膠成像分析軟件（America）分析，記錄每條蛋白電泳帶的灰度值，分析定量。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22.0對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間樣本比較應(yīng)用單因素方差分析（One-way ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，組間比較采用LSD-t檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心肌組織MMP-1 mRNA和蛋白的表達(dá)

與正常組比較，模型組MMP-1 mRNA和蛋白表達(dá)升高（P < 0.01）;與模型組比較，參草通脈顆粒組和賴諾普利組MMP-1 mRNA和蛋白均降低（P < 0.01）;與賴諾普利組比較，參草通脈顆粒組MMP-1 mRNA表達(dá)量降低（P < 0.05），而MMP-1蛋白表達(dá)升高（P < 0.05）。見表2。

2.2 各組大鼠心肌組織TIMP-1 mRNA和蛋白的表達(dá)

與正常組比較，模型組TIMP-1mRNA和蛋白表達(dá)下降（P < 0.01）;與模型組比較，參草通脈顆粒組和賴諾普利組TIMP-1 mRNA和蛋白均增加（P < 0.01）;與賴諾普利組比較，參草通脈顆粒組TIMP-1 mRNA和蛋白表達(dá)增加（P < 0.05）。見表3。

3 討論

CHF發(fā)生的基本機制是心室重構(gòu)，而細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的結(jié)構(gòu)和成分的改變、合成和降解的失衡，是導(dǎo)致心室重構(gòu)的重要原因[7]?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）對ECM有很高親和力，能特異地降解ECM[8]。金屬蛋白酶組織抑制物（TIMPs）可以抑制MMPs的活性，在正常心肌組織中，MMPs與TIMPs保持著動態(tài)平衡，共同維持著ECM合成與降解的平衡[9]。在衰竭的心肌組織中，MMPs活性升高導(dǎo)致纖維膠原降解、ECM重構(gòu)[10]。MMP-1是MMPs的一種，主要降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原[11]。TIMP-1與MMP-1有高度親和力，研究發(fā)現(xiàn)敲除TIMP-1的小鼠，心肌膠原含量下降，左室?guī)缀涡螤畎l(fā)生改變[12]。MMP-1與TIMP-1在正常組織中保持動態(tài)平衡，共同協(xié)調(diào)ECM的合成與降解，維持心肌組織結(jié)構(gòu)的完整性[13]。心衰的心臟中，MMP-1活性持續(xù)增高，TIMP活性降低，致使ECM合成與降解比例失調(diào)，心肌膠原纖維代謝紊亂，最終導(dǎo)致心室重構(gòu)的發(fā)生[14]。因此調(diào)節(jié)心肌MMP1與TIMP-1的表達(dá)和活性，成為控制心衰進(jìn)展中心臟基質(zhì)的組織修復(fù)和再生的重要治療手段[15]。

參草通脈顆粒是多年臨床治療CHF的經(jīng)驗方，試驗結(jié)果證明參草通脈顆?？擅黠@改善患者心功能分級，提高LVEF[3]。藥理學(xué)研究表明[16]，黃芪可改善心肌舒縮功能、抑制纖維化。人參可降低心肌膠原含量，減少心肌纖維化程度，延緩心室重構(gòu)[17-18]。紅花具有興奮心臟的作用，能增加冠狀動脈血流量、改善心肌缺血[19]。丹參可抑制Ca2+內(nèi)流，阻止心肌肥厚信號傳導(dǎo)[20]。益母草對心肌肥厚具有一定的抑制作用[21]。三七可提高Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性、改善離子轉(zhuǎn)運、抑制心肌膠原增生[22]。葶藶子和茯苓均具利尿消腫的作用[23-24]。

本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，參草通脈顆粒組和賴諾普利組MMP-1的基因和蛋白表達(dá)均降低，TIMP-1的mRNA和蛋白表達(dá)升高。與賴諾普利組比較，參草通脈顆粒組MMP-1的mRNA表達(dá)下降和TIMP-1 mRNA和蛋白表達(dá)升高，MMP-1蛋白表達(dá)升高。

綜上所述，參草通脈顆粒能夠抑制MMP-1表達(dá)，上調(diào)TIMP-1表達(dá)，增強TIMP-1對MMP-1的抑制作用，調(diào)節(jié)ECM合成與降解比例，維持心肌膠原蛋白的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，阻止室壁變薄和心室擴張，具有抗心室重構(gòu)的作用。

[參考文獻(xiàn)]

[1]? 周天玖，楊旭.慢性心力衰竭的非藥物性治療研究[J].健康必讀，2011，24（5）：199.

[2]? 仇慶華.貝那普利聯(lián)合美托洛爾治療老年原發(fā)性高血壓合并心力衰竭的療效[J].中國實用醫(yī)藥，2016，11（22）：190-191.

[3]? 楊碩，張艷，王思尹.益氣活血利水法治療慢性心衰臨床療效觀察[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2015，17（6）：70-72.

[4]? 國家藥典委員會.中國藥典[S].一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

[5]? 秦川.實驗動物學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2010：186-188.

[6]? Jiang C，Guo JM，Wang Z，et a1. Decursin and decursinol an-gelate inhibit estrolgen-stimulated and estrogen—independent growth and survival of breast cancer cells [J]. Breast Cancer Res，2007，9（6）：77-89.

[7]? 楊永健，張鑫，朱文玲.基質(zhì)金屬蛋白酶參與心力衰竭患者心肌細(xì)胞外基質(zhì)的調(diào)控[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2006，86（24）：1693-1696.

[8]? Spinale FG，Coker ML，Bond BR，et al. Myocardial matrixd egradation and m etalloproteinase activation in the failing heart：a potential therapeu tic target [J].Cardiovasc Res，2000，46（2）：225-238.

[9]? Tanus-Santos JE. Editorial：matrix metalloproteinases：drug targets in cardiovascular diseases [J]. Curr Drug Targets，2013，14（3）：275.

[10]? Yabluchanskiy A，Li Y，Chilton RJ. Lindsey ML matrix metalloproteinases：drug targets for myocardial infarction [J]. Curr Drug Targets，2013，14（3）：276-286.

[11]? Fry C，Kirby T，Kosmac K3，et al. Myogenic progenitor cells control extracellular matrix production by fibroblasts during skeletal muscle hypertrophy [J]. Cell Stem Cell，2017，20（1）：56-69.

[12]? Roten L，Nemoto S，Simsic J，et al. Effects of gene deletion of the tissue inhibitor of the matrix metalloproteinase-type 1（TIMP-1）on left ventricular geometry and function in mice [J]. J Mol Cell Cardiol，2000，32（1）：109-120.

[13]? Guzzoni V，Ribeiro M，Lopes GN，et al. Effect of resistance training on extracellular matrix adaptations in skeletal muscle of older rats [J]. Front Physiol，2018，11（9）：374.

[14]? Ding J，Chang YY，Li WJ，et al. The effects of DAPT intervention on the expression of α-SMA and MMP-1/TIMP- 1 in rats cardiac fibroblasts [J]. J Clin Cardio，2016，32（7）：735-738.

[15]? WANG QY，WANG WJ，XI J，et al. Effect of polysaccharides from eucommiae cortex on expressions of genes of Ⅰ，Ⅲ collagen，MMP-1，TIM MP-1 and TGF-β1 from hepatic fibrosis in rat models [J]. Chinese Journal of ETMF，2018，24（23）：153-158.

[16]? 桑震池，劉宗軍.黃芪對改善心力衰竭的作用及其機制研究[J].系統(tǒng)醫(yī)學(xué)，2016，1（12）：163-165.

[17]? 葉康，顧嘉霖，高俊杰.中藥人參治療慢性心力衰竭的研究進(jìn)展[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2017，15（5）：559-561.

[18]? 楊向陽，鄭大為，牟宗毅，等.益氣溫陽方對慢性心力衰竭大鼠心功能改善的作用及其機制研究[J].臨床和實驗醫(yī)學(xué)雜志，2020，19（8）：811-815.

[19]? 邵禮梅，許世偉，蘇玉娟.紅花藥物分析、化學(xué)成分及現(xiàn)代藥理研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥信息，2017，34（2）：123-125.

[20]? 梁茜，李煒杰，楊希立.復(fù)方丹參滴丸改善心肌缺血再灌注損傷研究進(jìn)展[J].中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2020，14（7）：236-238.

[21]? 喬晶晶，吳啟南.益母草化學(xué)成分與藥理作用研究進(jìn)展[J].中草藥，2018，49（23）：5691-5704.

[22]? 羅凱，張騰，陳瑜.三七總皂苷調(diào)節(jié)能量代謝干預(yù)心肌細(xì)胞肥大的效應(yīng)機制研究[J].世界科學(xué)技術(shù)，2019，21（10）：2073-2080.

[23]? 張國順，白義萍，王小蘭，等.葶藶子抗心衰有效組分篩選及其作用機制分析[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2017， 23（4）：118-125.

[24]? 韓雪瑩，肖航，竇德強.茯苓對正常大鼠物質(zhì)與能量代謝、內(nèi)分泌系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)的影響[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2020，20（9）：198-201.

（收稿日期：2020-04-16）

[基金項目] 國家自然科學(xué)基金資助項目（81774157）。

[作者簡介] 劉曉蕾（1983.6-），女，碩士;研究方向：中醫(yī)藥防治心腦血管疾病。

[通訊作者] 張艷（1960.10-），女，博士，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師;研究方向：中醫(yī)藥防治心腦血管疾病。