王美昌 于斌 張煒 林丹櫻 屈軍樂

(深圳大學物理與光電工程學院, 光電子器件與系統(tǒng)教育部/廣東省重點實驗室, 深圳 518060)

在激光掃描共聚焦顯微鏡的基礎上, 線掃描熒光顯微術利用線掃描代替點掃描, 提升圖像獲取速度, 具有系統(tǒng)結構簡單、成像速度快、光毒性弱、更適合于活體厚樣品的高分辨快速成像, 對于生命科學和生物醫(yī)學等領域的研究具有重要的意義. 然而, 目前的線掃描顯微技術在系統(tǒng)靈活性、成像速度、分辨率和光學層析能力等方面仍面臨著許多亟需解決的問題. 因此, 本文提出一種基于數(shù)字微鏡器件(digital micromirror device,DMD)的數(shù)字線掃描熒光顯微(digital line-scanning fluorescence microscopy, DLSFM)成像方法和系統(tǒng), 在照明光路中引入高速空間光調(diào)制器DMD 實現(xiàn)多線并行掃描激發(fā), 簡化光學系統(tǒng), 提升系統(tǒng)靈活性和掃描速度;提出基于熒光信號標準差的DLSFM 圖像重構算法, 結合三維Landweber 解卷積算法實現(xiàn)了三維高分辨光切片圖像重構. 在此基礎上, 利用搭建DLSFM 開展了熒光珠和老鼠腎切片標準樣品的成像實驗, 實驗結果表明, DLSFM 具有快速三維高分辨層析成像能力.

1 引 言

激光掃描共聚焦顯微鏡(laser scanning confocal microscope, LSCM)[1,2]具有光學層析能力強、信噪比和分辨率高等優(yōu)勢, 是生物成像必不可少的重要工具之一[3?7]. 但是, 傳統(tǒng)的LSCM 通常采用檢流式掃描振鏡進行逐點掃描, 其慢的成像速度和大的光毒性大大阻礙了其在活細胞成像中的進一步的應用. 為了進一步提高LSCM 的成像速度, 目前已發(fā)展了基于轉盤(Nipkow disk)[8]、共振振鏡[9]、多面轉鏡[10,11]等多種掃描方式的LSCM.轉盤式LSCM 成像速度可達25 幀/秒 (frames per second, fps), 但其光通量低, 成像條件苛刻; 基于多面轉鏡和共振振鏡掃描的LSCM, 成像速度達到30 fps, 但光學系統(tǒng)復雜、掃描系統(tǒng)的同步控制電路復雜、價格高. 為了突破這些限制, 進一步提升LSCM 的圖像獲取速度, 線掃描顯微技術(linescanning microscopy , LSM)應運而生. 1988 年,Sheppard 等[12]首先提出了應用狹縫代替針孔的掃描顯微技術, 利用線掃描代替點掃描, 大大提升了成像速度和較低了激發(fā)光強度, 更適用于活細胞和組織成像[13,14]; 隨后, Reto 等[15]在此基礎之上提出了一種虛擬狹縫掃描顯微術, 提升了各向異性的成像空間分辨率, 但是其成像速度卻受到了制約;針對這一問題, Kang 等[16]提出了一種基于聲光偏轉器的高速線掃描共焦顯微術, 其成像速率為191 fps, 但該系統(tǒng)不適用于生物樣品熒光信號的測量; 為了進一步提高LSM 的空間分辨率, Ondrej等[17]提出了線掃描結構光照明顯微技術(line scan-structured illumination microscopy, LS-SIM),實現(xiàn)了厚樣品的超分辨成像, 但系統(tǒng)和圖像重構算法相對復雜, 成像速度較慢. 為了進一步簡化系統(tǒng),研究人員提出了基于虛擬結構光探測(virtually structured detection, VSD)的超分辨線掃描顯微成像技術(VSD-LSM)[18?20], 實現(xiàn)了超分辨線掃描顯微成像. 為了降低系統(tǒng)成本, 簡化LSM 系統(tǒng), Vakili等[21]發(fā)展了基于高亮度線陣發(fā)光二級管(LED)的線掃描共聚焦顯微鏡. 近年來, LSM 已廣泛應用于生物醫(yī)學研究的各個領域[22?26].

另外, 在LSM 的圖像重構算法方面, 目前主要有基于虛擬狹縫的圖像重構方法, 但是該方法對狹縫尺寸有特定要求, 尺寸過大導致離焦信號不能完全濾除, 過小會導致在焦信號被濾除, 引起圖像信息缺失. 因此, Rainer 等[27]提出了基于結構光場激發(fā)的高分辨熒光顯微圖像重構方法, 避免了狹縫式濾除離焦信號的過程, 有效提升了圖像分辨率. 但是, 其重構圖像中存在偽影, 導致圖像模糊.隨后, 也有研究人員利用解卷積(deconvolution,DE)算法處理LSM 圖像, 但分辨率的提升并不明顯.

因此, 線掃描顯微技術在成像速度、分辨率和光學層析能力等方面仍面臨著許多亟需解決的問題, 研究和開發(fā)新型線掃描顯微成像技術系統(tǒng)及相關圖像重構算法, 進一步提升其性能, 使其更適用于活體厚樣品例如活體完整細胞和組織等的高分辨快速三維成像, 對于生命科學和生物醫(yī)學等領域的研究具有重要的意義. 數(shù)字微鏡器件(digital micromirror device, DMD)作為高速數(shù)字光處理器件, 已廣泛應用于投影、顯示、無掩模光刻、光學測量、成像、全息等領域[28,29]. Vienola 等[30]以DMD作為掃描器件建立了數(shù)字線掃描檢眼鏡成像系統(tǒng),但該系統(tǒng)并不適用于生物樣品熒光信號測量. 本文在實驗室現(xiàn)有多焦點結構光照明顯微鏡的基礎上[31],提出了一種基于DMD 的數(shù)字線掃描熒光顯微成像方法(digital line-scanning fluorescence microscopy, DLSFM), 并搭建了相關顯微系統(tǒng), 開展了老鼠腎切片標準樣品的三維光切片顯微成像實驗;提出基于熒光信號標準差的DLSFM 圖像重構算法并編制了其圖像重構程序, 結合三維Landweber DE 算法[32]實現(xiàn)了三維高分辨光切片層析圖像重構, 實驗結果證明了系統(tǒng)的可靠性, 為LSM 進一步發(fā)展及其在對完整活細胞等厚樣品快速高分辨成像方面提供理論和技術基礎.

2 DLSFM 的基本原理

2.1 系統(tǒng)光路設計

DLSFM 光路如圖1 所示, 首先, 波長為488 nm固體激光器發(fā)出的光束, 經(jīng)過一個4f擴束系統(tǒng), 將入射光束的光斑直徑擴大6 倍; 隨后, 擴束后的激光光束被反射鏡以特定角度反射到DMD 面板上,并被開(on)狀態(tài)的微鏡反射進入后續(xù)的4f系統(tǒng),其中4f系統(tǒng)的前焦面與DMD 面板重合, 并將光闌(Iris)放置在4f系統(tǒng)的傅里葉面, 用來濾除多余衍射級的反射光; 隨后, 光線匯聚在4f系統(tǒng)的后焦面上形成稀疏的線條陣列, 其軸向位置與管鏡前焦面重合; 最后, 被聚焦的線條陣列經(jīng)管鏡和物鏡后縮小1/90, 成像到樣品面上, 從而形成最終的多線陣激發(fā)模式. 實驗中, DMD 面板的像素數(shù)為1024 ×768, 像素尺寸為10.8 μm × 10.8 μm, 經(jīng)過后續(xù)光學系統(tǒng)的縮放, 在樣品面上對應的尺寸為120 nm ×120 nm. 最后, 由樣品被激發(fā)后產(chǎn)生的熒光信號通過物鏡(尼康, 60 ×,NA= 1.27 水鏡)、二向色鏡和管鏡, 聚焦到高靈敏度相機(scientific CMOS,sCMOS)(濱松, ORCA Flash 4.0 V2, 像素數(shù)2048 ×2048, 像素尺寸6.5 μm × 6.5 μm)上形成樣品的像. 樣品放在三維高精度電動納米位移臺上(PI,P-545.3R7Z PINano XYZ), 主要通過其進行軸向掃描, 結合DMD 的橫向掃描, 最終實現(xiàn)樣品的三維成像. 另外, 由于PI 納米位移臺在三個方向的重復精度優(yōu)于5 nm, 遠小于樣品面的像素尺寸120 nm,確保了系統(tǒng)的穩(wěn)定性, 因此, 軸向掃描過程對系統(tǒng)分辨率的影響可以忽略不計.

2.2 系統(tǒng)信噪比特性分析

在DLSFM 成像過程中, 通過控制DMD 每列像素的“開”和“關”即偏轉角度來生成多條平行線光束, 同時對樣品掃描成像. 因此, 成像視場內(nèi)掃描線的多少和間距決定了成像的速度和信噪比(single-to-noise ratio, SNR), 所以, 在設計系統(tǒng)時,需要綜合考慮這兩個因素. 為了分析SNR 特性,定義DMD 的填充因子F(fill factor),

圖1 DLSFM 系統(tǒng)光路示意圖Fig. 1. Schematic diagram of DLSFM system.

其中,N為DMD 的微反射鏡總數(shù)量,n為開狀態(tài)下的DMD 微反射鏡數(shù)量.

首先, 通過對均勻的羅丹明熒光溶液進行線掃描成像來分析F與掃描線數(shù)的關系, 如圖2 所示.通過采集單幀不同密度線條紋激發(fā)下的羅丹明熒光溶液圖像, 如圖2(a)所示, 并對采集的熒光溶液圖像不同幀的同一平行線位置的橫截面寬度進行計算, 如圖2(b)所示.

圖2 DMD 不同填充因子的數(shù)字線掃描成像分析 (a)不同密度線條紋激發(fā)下的羅丹明熒光溶液圖像; (b) 不同幀的同掃描線位置的強度輪廓線Fig. 2. Digital line scan imaging analysis of DMD with different fill factor: (a) The rhodamine fluorescence solution images excited by different density scanning lines; (b) the intensity profiles through the dotted line in (a).

從圖2(b)中看出, 隨著F的增大, 不同線密度條件下激發(fā)樣片產(chǎn)生熒光線條的橫截面寬度幾乎接近于一恒定值, 但當F增大到0.0566 時, 可以看出線條的橫截面強度除了中心的主峰強度外, 有一些旁瓣信號, 這主要是由于高線密度下平行線間的散射光和離焦信號導致的. 因此, 為了獲取理想F情況下平行線陣列的激發(fā)數(shù)目, 需對圖像SNR作進一步分析, 如圖3 所示. SNR 定義如下:

其中,Es表示焦面信號強度, Eb表示背景信號平均強度.

由圖3(b)看出, 隨著F的增大, 焦面信號和背景信號強度趨于線性變化, 而圖像SNR 逐漸減小(圖3(c)), 這主要是由于線密度增大使平行線陣列間的散射光信號導致了這一結果. 由圖2(b)、圖3(b),(c)看出, 當F為0.0208 時, SNR 比為94, 此時從物鏡口發(fā)出的光功率為177 μW, 采樣速率為250 Hz,重構一幅光切片圖像需要48 幀掃描圖像, 從成像時間和空間分辨效果進行綜合分析, 此時, 成像條件最佳. 因此, 由 (1) 式, 可以計算該條件下所需的線條紋陣列數(shù)為7, 從而為后續(xù)的實驗奠定了基礎.

圖3 DMD 不同填充因子的信噪比分析 (a) 焦面信號和背景信號強度分布圖; (b) 焦面信號和背景信號強度與DMD 填充因子的關系曲線; (c) DMD 不同填充因子的信噪比曲線Fig. 3. SNR analysis of DMD with different fill factor: (a) The intensity distributions of focal plane signal and background signal intensity; (b) the intensity curves of focal planne signal (black) and background signal (red); (c) the curve of the SNR versus fill factor of DMD.

3 DLSFM 圖像重構方法

在厚樣品的熒光顯微成像中, 由于熒光信號可在樣品成像的焦面和非焦面位置產(chǎn)生, 對于非焦面信號會對成像產(chǎn)生干擾, 降低圖像對比度進而影響成像分辨率, 對此, 研究人員提出了基于虛擬狹縫(virtual slit, VS)的圖像重構方法去處理, 但是該方法的處理過程受狹縫尺寸以及成像深度的限制.在前期的研究工作中提出了一種基于離焦信號和聚焦信號統(tǒng)計特性的多焦點結構光顯微層析成像重構方法[33], 可以有效保留聚焦信號和濾除離焦等低頻背景信號, 實現(xiàn)了厚樣品的高對比度層析成像. 本文在此基礎上, 將該方法用于DLSFM 的圖像重構, 用于抑制離焦背景信號, 進而提高其光切片能力和分辨率.

為了得到每個像元對應的標準差(standard deviation, STD)數(shù)值σ, 對每一層掃描圖像的像元強度分布情況進行統(tǒng)計計算, 其計算式中重構圖像每個像元的強度均值μ為不同掃描圖像中每個像元的強度值求平均而得到. 然后, 可以計算出重構圖像中每個像元的σ數(shù)值, 其表達式為

其中, (i,j) 表示圖像像元索引位置,μ(i,j) 表示重構圖像中每個像元的強度均值,p為采集的不同圖像,M為圖像數(shù),I(i,j,p) 表示索引位置像元的強度值,σ(i,j) 為重構圖像中每個像元的標準差.

通過上述公式對線掃描圖像序列進行處理, 抑制離焦背景噪聲, 獲得了DLSFM 圖像, 在此基礎上可結合三維Landweber DE 算法來進一步提高DLSFM 圖像的對比度和分辨率.

4 實驗結果分析與討論

4.1 系統(tǒng)分辨率標定

為了驗證DLSFM 的成像能力, 可通過測量直徑為100 nm 的熒光珠對該系統(tǒng)的分辨率進行標定, 對視場范圍內(nèi)25 顆熒光珠的圖像進行統(tǒng)計平均, 得到了系統(tǒng)在x,y,z方向的平均分辨率, 用熒光 珠 的 半 高 全 寬(full width at half maximum,FWHM)值來表征, 如圖4 所示.

首先, 利用線掃描原始圖像進行直接疊加, 獲得了熒光珠寬場(wide field, WF)圖像. 但WF 圖像離焦背景噪聲信號較強(圖4(a)), 熒光珠在x,y,z方向對應的平均FWHM 分別為286, 274 和854 nm.然后, 經(jīng)VS 圖像重構、STD 圖像重構及VS 圖像重構與Landweber DE 算法結合(STD + DE)處理后, 分辨率得到了一定的提升, 但是效果不是太明顯. 然而, 將STD 圖像重構與LandweberDE 算法結合(STD + DE)處理后其分辨率得到了進一步的改善, 熒光珠在x,y,z方向的平均FWHM 分別為215, 192 和720 nm, 為寬場條件下的1.33 倍、1.42 倍和1.19 倍. 考慮到熒光珠的尺寸, DLSFLM的實際空間分辨率略小熒光珠的FWHM.

圖4 100 nm 熒光珠標定的系統(tǒng)三維空間分辨率 (a)寬場圖像; (b)虛擬狹縫重構圖像; (c)標準差重構圖像; (d)虛擬狹縫與LW 解卷積組合重構圖像; (e)標準差與LW 解卷積組合重構圖像. 其右邊對應的直方圖為25 顆熒光珠在沿 x ,y,z 方向的FWHM分布, ,, 分別為其平均值Fig. 4. 3D spatial resolution of the system calibrated by the 100 nm fluorescent bead: (a) WF image; (b) VS image; (c) STD image;(d) VS + DE image; (e) STD + DE image. The corresponding histograms on the right show the measured distribution of x,y,z FWHM values from 25 beads.

4.2 老鼠腎切片三維成像實驗

接下來, 利用搭建的DLSFM 系統(tǒng), 選用熒光標記的老鼠腎切片(FluoCellTMprepared slide#3 mouse kidney section,*AF 488 WGA, AF 568 phalloidin, Product of US)作為實驗樣片, 選取其中厚度為11.2 μm 的腎小球作為實驗對象, 進行掃描成像, 樣品熒光發(fā)射光波長為568 nm, 樣品面像素尺寸大小為108 nm. 在成像采集過程中, DMD上7 條激發(fā)線橫向并行掃描的步數(shù)為48 步, 掃描速率為250 Hz, 三維電動納米位移臺軸向掃描間隔為200 nm. 因此, 共獲得2688 幅線掃描源圖像. 這些采集的樣品圖像經(jīng)VS、STD, 以及LandweberDE算法處理后獲得樣品的不同深度的光切片層析圖像, 如圖5 所示.

圖5 腎小球軸向光切片的重構圖像Fig. 5. Reconstructed slice images of the same glomerulus.

從圖5 中可以看出, WF 模糊不清, 大致能分辨外輪廓, 對于邊緣細節(jié)幾乎難以分辨開來, 經(jīng)VS 圖像重構方法處理后, 離焦信號得到了一定的去除, 邊緣細節(jié)得到了一定的凸顯; 然而, VS 圖像重構方法與STD 圖像重構方法成像相比, 其對比度與分辨率相對較低. 利用Landweber 解卷積算法在二者基礎之上進行處理, 其對比度及分辨率得到了進一步改善, 尤其是對于標準差圖像重構, 其經(jīng)解卷積算法處理后, 樣品細節(jié)結構得到了顯著的凸顯, 圖像分辨率得到了進一步的提升.

為了細致觀察其重構效果, 選取軸向深度處于8 μm 處的腎小球切片的一區(qū)域進行放大, 如圖6所示, 其中, 圖6(a)—(f)分別為WF 圖像、VS 圖像和STD 圖像; 圖6(a)—(c)分別經(jīng)Landweber DE 算法處理成像(圖6(d)—(f)); 圖6(i)—(n)分別為圖6(a)—(f)黃色線框區(qū)域的放大.

圖6 不同算法的圖像重構細節(jié)比較 (a)?(c) 分別為WF 圖像、VS 圖像和STD 圖像; (d)?(f) 分別由(a)?(c)經(jīng)Landweber DE 算法處理成像; (i)?(n) 分別為圖(a)?(f)黃色線框區(qū)域的放大圖Fig. 6. Comparison of image reconstruction details of different algorithms: (a)?(f) WF image, VS image, and STD image; (d)?(f) the Landweber DE images for (a)?(c); (i)?(n) magnified view of the yellow rectangular areas in (a)?(f).

從圖6 可以看出, 經(jīng)由圖6(a)—(f)黃色線框分別放大后的圖6(i)—(n), 其中, 圖6(l)—(n)在圖6(i)—(k)的基礎之上分辨率得到了進一步提升,尤其是對于圖6(n), 與圖6(m)相比, 其樣品結構凸顯得尤為明顯. 因此, 說明了數(shù)字線掃描WF、VS 圖像重構、STD 圖像重構經(jīng)Landweber 算法解卷積后圖像分辨率得到進一步的提升, 其中STD 圖像對比度以及分辨率明顯比VS 圖像重構的要高, 如圖7 所示, 其中, 圖7(a)—(c)分別為WF 圖像、VS 圖像和STD 圖像; 圖7(d)—(f)分別為圖7(a)—(c)經(jīng)Landweber 解卷積算法處理成像; 圖7(g)和7(h)分別為圖7(a)—(f)白色虛線位置的歸一化強度擬合.

從圖7(g),(h)可以看出, 通過Landweber DE 算法處理前后, STD 圖像重構的強度明顯比VS 圖像重構的要高, 與此同時, 處理后整體比處理前的要大(如圖7(g), (h)所示). 處理前,STD 圖像、VS 圖像、WF 圖像的歸一化強度變化量分別為:d3= 0.69,d2= 0.32,d1= 0.04; 處理后, 其分別為:d3= 1.00,d2= 0.66,d1= 0.24. 因此, 進一步驗證了我們所述的結論.

根據(jù)對系統(tǒng)的分辨率測試和對固定生物樣品成像結果可以看出, 系統(tǒng)的成像分辨率基本上接近系統(tǒng)理論的成像分辨率, 在生物樣品成像過程中具有良好的信噪比.

5 總 結

本文實現(xiàn)了一種基于數(shù)字微鏡器件的線掃描熒光顯微成像系統(tǒng), 通過超高速DMD 空間光調(diào)制器實現(xiàn)了多線并行數(shù)字線掃描熒光顯微成像, 簡化及智能化了系統(tǒng)掃描裝置, 提高了其時空分辨率;建立了基于標準差的線掃描顯微圖像重構方法, 并將其與Landweber 解卷積算法相結合, 實現(xiàn)了三維高分辨率光切片圖像重構, 實驗表明系統(tǒng)x,y,z方向的分辨率分別為寬場條件下的1.33 倍、1.42 倍和1.19 倍, 并實現(xiàn)了對生物樣本的三維高分辨率層析成像, 為進一步開展活體完整細胞及組織等厚樣品快速高分辨成像奠定了技術基礎.

圖7 不同算法重構圖像的對比度比較(a)?(c)分別為WF圖像、VS圖像和STD圖像;(d)?(f)分別為圖(a)?(c)經(jīng)Landwebe 解卷積算法處理成像;(g)?(h)分別為圖(a)?(f)白色虛線位置的歸一化強度輪廓圖Fig.7.Contrast com parison of reconstructed images with different algorithm s:(a)?(c)W F image,VS image,and STD image;(d)?(f)images obtained from(a)?(c)processed by Landwebe deconvolution algorithm;(g)?(h)the norm alized intensity profiles through the white dotted line position in (a)?(f).