崔建偉 崔 瀟 劉雪艷 李成萍 郭 彥 周國利

(聊城大學 生命科學學院，山東 聊城 252059)

0 引言

在1970s早期，首次在RNA上發(fā)現(xiàn)重復(fù)的poly(A)尾.當時對RNA是如何或為什么會有poly(A)尾知之甚少，但已經(jīng)推測它是一種可能與翻譯或mRNA的形成和運輸有關(guān)的信號序列[1].在接下來的幾年里，這些預(yù)測得到了驗證，并且poly(A)尾的動態(tài)調(diào)節(jié)過程變得更加清晰，大量調(diào)節(jié)poly(A)尾長度的聚合酶和脫腺苷酸化酶已經(jīng)被鑒定[2-4].Poly(A)尾在真核生物mRNA轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中具有關(guān)鍵的功能，是mRNA穩(wěn)定性和翻譯的重要決定元件.盡管poly(A)尾如此重要，但被發(fā)現(xiàn)后的幾十年里，其序列竟然極少被精確解讀過.主要原因在于，擴增簡單串聯(lián)的單核苷酸序列會導致聚合酶滑動，從而造成測序結(jié)果的移碼和亂碼.近幾年，針對poly(A)尾的高通量測序技術(shù)的建立和快速發(fā)展，使poly(A)尾的精確測序得以實現(xiàn)，poly(A)尾在mRNA轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中關(guān)鍵作用正的逐漸被揭示.

1 Poly(A)尾是RNA的一種重要的動態(tài)修飾

幾乎所有真核生物的mRNA都包含一個多聚腺苷酸信號(polyadenylation signal，PAS)序列.PAS和其下游富含GU或U的堿基序列通過招募多個參與3′ 端加工的蛋白復(fù)合物來指導poly(A)尾的形成[5].多聚腺苷酸化發(fā)生的位置不是由RNA聚合酶終止pre-mRNA的合成決定的；相反，RNA的剪切是在PAS下游10-30 nt范圍內(nèi)發(fā)生的，poly(A)聚合酶(poly(A) polymerase，PAP)隨后在其3′末端加入poly(A)尾.一旦11-14個腺苷酸被加入，細胞核poly(A)結(jié)合蛋白(nuclear poly(A) binding protein，PABPN)能夠結(jié)合正在延伸的poly(A)尾[6].然后PAP能夠快速合成一個全長poly(A)尾，poly(A)長度一般認為是200-250 nt[7]，但是否所有轉(zhuǎn)錄本在所有組織中都“完全”加250個左右的腺苷酸并不完全清楚.例如，一些基因被發(fā)現(xiàn)含有一個poly(A)限制元件(a poly(A) limiting element，PLE)，它的作用是將pre-mRNA上poly(A)尾的初始長度限制在20 nt以下[8].在一些長鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs，lncRNAs)和一些小非編碼RNA也被發(fā)現(xiàn)含有poly(A)尾[9].

剪切和多聚腺苷酸化的過程被認為是mRNA從細胞核正確地輸出到細胞質(zhì)中所必要的.一旦進入細胞質(zhì)，poly(A)尾主要被胞質(zhì)poly(A)結(jié)合蛋白(cytoplasmic poly(A)-binding protein，PABPC)結(jié)合，但關(guān)于PABPN和PABPC在poly(A)尾上的轉(zhuǎn)換知之甚少.雖然兩者可以在細胞質(zhì)和細胞核之間穿梭的蛋白質(zhì)，但它們之間是如何及何時完成的交換還不清楚.新合成轉(zhuǎn)錄本上所需要的蛋白質(zhì)與細胞質(zhì)中正在轉(zhuǎn)譯的mRNA上所需的蛋白質(zhì)種類有很大的不同，其中許多蛋白質(zhì)必須發(fā)生重構(gòu)才能使各自過程順利進行[10].研究發(fā)現(xiàn)，PABPN缺乏任何重復(fù)的足跡圖譜，但PABPC可重復(fù)地結(jié)合到poly(A)尾20-30個腺苷核苷酸序列上[11].PABPC通過與其它反式作用因子的相互作用，進而在mRNA的穩(wěn)定性和翻譯中發(fā)揮重要的作用.它通過與5' 帽子結(jié)合復(fù)合物中的真核翻譯起始因子4F(eukaryotic translation initiation factor 4F，eIF4F)和真核翻譯釋放因子3(eukaryotic translation release factor，eRF3)的結(jié)合[12]，通過這些相互作用，PABPC和poly(A)尾協(xié)同促進翻譯.盡管PABPC與mRNA的保護和穩(wěn)定性有關(guān)，但它還能招募脫腺苷酸化酶，PABPC這個看似矛盾的角色說明它在poly(A)尾轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中具有雙重作用，具體的作用機制還需要進一步的闡明.由于還存在其他因子與poly(A)尾結(jié)合，如La蛋白可以與poly(A)尾結(jié)合，并同時與PABPC結(jié)合可能對翻譯具有調(diào)節(jié)作用，這此因子的結(jié)合使poly(A)尾所結(jié)合的相互作用因子更加復(fù)雜[13].從poly(A)尾合成到降解的過程中，poly(A)尾和各種蛋白質(zhì)因子之間存在著多方面的關(guān)系，從而在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮著不同的作用.

2 Poly(A)尾長度與基因表達、翻譯的關(guān)系

Poly(A)尾是保護mRNA的“看門人”，因為降解mRNA的酶必須從3' 端開始降解整個poly(A)尾，才能影響到蛋白質(zhì)編碼區(qū)，這將使poly(A)尾的長度必須處在一個關(guān)鍵閾值范圍內(nèi)才能保護mRNA不被降解.幾十年來的傳統(tǒng)觀點認為，較長的poly(A)尾對其mRNA穩(wěn)定性和翻譯具有積極的影響[2,14].但是與大多數(shù)poly(A)尾很長的想法相反，發(fā)現(xiàn)一些轉(zhuǎn)錄本poly(A)尾的長度比預(yù)期的短很多，一些非常穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄本(如編碼β-actin的轉(zhuǎn)錄本)具有短的poly(A)尾，長度小于30 nt[15,16].總之，發(fā)現(xiàn)短poly(A)尾的轉(zhuǎn)錄本比之前預(yù)期的要多，那么，Poly(A)尾長度與轉(zhuǎn)錄本穩(wěn)定性和翻譯的關(guān)系及其生物學意義是什么？

隨著針對poly(A)尾的新測序方法的出現(xiàn)，poly(A)尾長度的轉(zhuǎn)錄組動態(tài)變化圖譜變得逐漸清晰.研究發(fā)現(xiàn)不僅有許多短poly(A)尾的物種存在，而且所研究物種(人、果蠅、小鼠和線蟲等)的mRNA poly(A)尾長度的中值都在50-100 nt的長度范圍內(nèi)[17-19].唯一的例外是酵母，其poly(A)尾長度的中值約為33 nt，但酵母poly(A)尾的初始長度約為90 nt左右[20]，這實際上與前面的物種相比并沒有什么不同.研究發(fā)現(xiàn)短poly(A)尾與表達水平和翻譯效率高的基因相關(guān)，更長的poly(A)尾與表達水平和翻譯效率低的轉(zhuǎn)錄本有關(guān)，還發(fā)現(xiàn)poly(A)尾的長度與轉(zhuǎn)錄本的半衰期呈負相關(guān).而且這些縮短的poly(A)尾看起來并沒有降解的趨勢，因為它們在穩(wěn)定狀態(tài)下以離散長度積累，而不是以連續(xù)長度方式積累[19]，這個重大發(fā)現(xiàn)反駁了長poly(A)尾更有利于保護mRNA和翻譯的觀點.這與早期的報道一致，發(fā)現(xiàn)短poly(A)尾與正在生長的盤基網(wǎng)柄菌(Dictyosteliumdiscoideum)細胞中的mRNA穩(wěn)定性相關(guān)[21].發(fā)現(xiàn)的另一個有趣的特征是poly(A)尾的長度存在一個相位模式，其中預(yù)期與PABPC(cytoplasmic poly(A)-binding protein)串行結(jié)合的poly(A)尾會得到更大富集[19, 22].這些與PABPC串行結(jié)合的poly(A)尾的富集表明，不受保護的腺苷酸可能很快被移除.有趣的是，這種相位模式的分布只在mRNA的poly(A)尾上發(fā)現(xiàn)，而在其他含有poly(A)尾但不能翻譯的RNA上沒有發(fā)現(xiàn)，如lncRNAs(long noncoding RNAs)，而且發(fā)現(xiàn)表達水平和翻譯效率高的轉(zhuǎn)錄本相位模式最為明顯，表明poly(A)尾縮短到離散長度(稱為修剪)是一個與翻譯活動相關(guān)的過程[19].

而在卵母細胞成熟和早期胚胎發(fā)育期間，胞質(zhì)內(nèi)選擇性地多聚腺苷酸化延長了特定mRNA的poly(A)尾，而且這個延長的結(jié)果確實增加了翻譯，從而重新激活沉默的轉(zhuǎn)錄本[18, 23-25].胞質(zhì)內(nèi)多聚腺苷酸化也被發(fā)現(xiàn)可以激活一些神經(jīng)元轉(zhuǎn)錄本[26].最近研究也發(fā)現(xiàn)poly(A)尾長度與GV(germinal vesicle)期卵母細胞內(nèi)的蛋白表達水平呈正相關(guān)，表明較長的poly(A)尾會促進卵母細胞中的翻譯過程[27].另外，利用TED-Seq(tail-end displacement sequencing)技術(shù)對人類細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的研究結(jié)果顯示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導致某些mRNA poly(A)尾的長度增加，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)節(jié)因子XBP1(X-box binding protein 1)、DDIT3(DNA-damage inducible transcript 3)和HSPA5(heat shock protein 5).重要的是，poly(A)尾長度增加的mRNA在翻譯上是去抑制和穩(wěn)定的[28].總之，TED-Seq揭示了poly(A)長度是隨著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激變化而發(fā)生動態(tài)變化的，這對翻譯和mRNA轉(zhuǎn)換都有潛在的影響.研究也發(fā)現(xiàn)3'UTR(3' untranslated region)長度與poly(A)尾長度相關(guān)，相同基因的選擇性多聚腺苷酸化(alternative polyadenylation，APA)位點及選擇性啟動子與不同的poly(A)尾長度相關(guān)[29].這些研究結(jié)果提示，poly(A)尾的長度變化在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中具有重要作用，而且在不同的生物學過程中的作用方式和結(jié)果也是多樣的、復(fù)雜的.

3 Poly(A)尾異質(zhì)性的發(fā)現(xiàn)及其在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中的作用

mRNA的poly(A)尾曾被認為是純A的，且除了長度變化外幾乎沒有什么其他信息內(nèi)容.但近幾年的研究表明，poly(A)尾的堿基組成也是可變的.對HeLa和NIH3T3細胞系進行TAIL-Seq，發(fā)現(xiàn)poly(A)尾內(nèi)存在非A堿基的異質(zhì)性，G主要在大于40 nt的poly(A) 尾中發(fā)現(xiàn)，而U通常發(fā)現(xiàn)， 在小于25 nt的poly(A)尾上[17].而且在人、小鼠、青蛙和魚類等物種中，發(fā)現(xiàn)它們都有一定比例的異質(zhì)性poly(A)尾存在[17-19, 34].通過PAIso-Seq(poly(A) inclusive RNA isoform sequencing)也揭示了在小鼠GV期卵母細胞中有超過17%的mRNA poly(A)尾中廣泛存在U、G和C堿基的摻入，除單個出現(xiàn)外，非A堿基也會呈2-4個連續(xù)出現(xiàn)的情況.與Chang等(2014)[17]的發(fā)現(xiàn)一致，U堿基更多出現(xiàn)在poly(A)尾較短的轉(zhuǎn)錄本中，G和C堿基較多出現(xiàn)在poly(A)尾較長的轉(zhuǎn)錄本中[27].這些發(fā)現(xiàn)提示，poly(A)尾內(nèi)非A堿基的異質(zhì)性可能對mRNAs穩(wěn)定性和翻譯具有不同的功能及調(diào)控機制.

在mRNA加尾時，TENT4A/B(terminal nucleotidyltransferase 4A/B)核苷酸轉(zhuǎn)移酶能間歇性地添加G.有趣的是，G主要位于poly(A)尾部末端，或者與末端相鄰的位置.通過對非A堿基功能的研究發(fā)現(xiàn)，一個G就足以阻止脫腺苷酸化酶CCR4-NOT(carbon catabolite repression 4-negative on TATA-less)復(fù)合體對poly(A)尾部的修剪，因為修剪到3'端暴露G時會阻止該酶復(fù)合體的繼續(xù)修剪.TENT4A和TENT4B的缺失會導致細胞中mRNA半衰期和豐度降低[30].因此，TENT4A和TENT4B產(chǎn)生一個異質(zhì)性的poly(A)尾，保護相應(yīng)mRNA的poly(A)免受快速的脫腺苷酸化，揭示了一種全新的mRNA保護作用和機制，擴大了轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的復(fù)雜性.在擬南芥的poly(A)尾中也存在非A堿基，而且也是G的比例最高，10%的poly(A)尾內(nèi)含有至少一個G，其G含量分布范圍為0.8-28%.通過進一步聯(lián)合CLIP-Seq、Ribo-Seq和mRNA穩(wěn)定性實驗等進行研究，發(fā)現(xiàn)在poly(A)尾中G含量的差別可導致AtPAB(Arabidopsis thaliana poly(A)-binding proteins)對不同mRNA結(jié)合的差異，且G可通過對AtPAB結(jié)合的抑制效應(yīng)下調(diào)mRNA翻譯效率，而與mRNA穩(wěn)定性無關(guān).當特定AtPAB缺失時，具有更強AtPAB結(jié)合的基因表現(xiàn)出更低的翻譯效率.該研究提供了一種新的機制，即基因的翻譯效率可以通過G含量依賴的PAB結(jié)合來調(diào)節(jié)[31].其他的研究發(fā)現(xiàn)與poly(A)尾結(jié)合的PABPC抑制尿苷酸化，而miRNA靶向誘導尿苷化的發(fā)生[32-34].在poly(A)尾上雖然也發(fā)現(xiàn)了C的加入，但其生物學功能尚未明確[17,30].

4 PABPC在poly(A)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中的雙重作用

Poly(A)尾促進了mRNA和許多蛋白質(zhì)之間的相互作用，多種蛋白的相互作用是通過與高親和力的poly(A)尾結(jié)合的PABPs發(fā)生的[35].由于PABPC在基因表達中所起的作用似乎是相互矛盾的，因此其確切作用至今仍不清楚.一方面，它可以通過直接與脫腺苷酸化酶復(fù)合物PAN2-PAN3(poly(A) specific ribonuclease subunit2、3)和CCR4-NOT結(jié)合來促進脫腺苷酸化[36, 37].但它也是公認的一種直接與poly(A)尾結(jié)合并保護其不降解的蛋白質(zhì)[38].另外，PABPC通過與5' 帽子結(jié)合因子和eRF3相互作用，被認為可以促進翻譯.作為一種可以招募脫腺苷酸化酶的蛋白質(zhì)，它也參與了基因轉(zhuǎn)錄本的降解和下調(diào)，PABPC的這種雙重效應(yīng)的作用機制需要在不同的生理過程中進一步的研究.

一個重大的突破是確定了在PABPC存在下CCR4(CCR4-NOT transcription complex subunit 6)和CAF1(CCR4-NOT transcription complex subunit 7)酶的脫腺苷酸化酶活性，這兩種酶是CCR4-NOT復(fù)合物的組成部分.研究酵母菌和人的脫腺苷酸化酶的兩個不同小組同時發(fā)現(xiàn)，結(jié)合在poly(A)尾上的PABPC(酵母中為Pab1)不阻礙CCR4的活性，因為CCR4可以把PABPC從poly(A)尾上釋放后繼續(xù)進行脫腺苷酸化，而CAF1(CCR4-NOT transcription complex, subunit 7)只能去除PABPC保護范圍外的腺苷酸[22,37].PAN2/3只是選擇性修剪大于150 nt的poly(A)尾，對轉(zhuǎn)錄組的影響很小；而PARN(poly(A) specific ribonuclease)不影響poly(A)尾的脫腺苷酸化[22].但PABPC仍在招募中起著中心作用，因為Pab1的消耗導致CCR4-NOT復(fù)合體的脫腺苷酸化速率大大降低[37].這些不同的功能角色暗示了poly(A)尾部的PABPC可能導致尾部長度的動態(tài)變化.

研究發(fā)現(xiàn)CCR4和CAF1脫腺苷酸化也受密碼子優(yōu)化的影響，而密碼子優(yōu)化是與翻譯狀態(tài)緊密相關(guān)的.使用報告基因系統(tǒng)，密碼子優(yōu)化程度較低的轉(zhuǎn)錄本比優(yōu)化較高的轉(zhuǎn)錄本脫腺苷酸化速度更快.此外，抑制CAF1的表達，優(yōu)先影響密碼子優(yōu)化程度較低的報告基因的脫腺苷酸化速率，可能表明其poly(A)尾部的PABPC結(jié)合可能更少，這表明相對于高水平翻譯的轉(zhuǎn)錄本，CAF1在低水平翻譯時顯得更活躍[37, 39].這些研究再次將翻譯和poly(A)尾長度緊密聯(lián)系在一起，而PABPC是調(diào)節(jié)這種關(guān)系的主要參與者.關(guān)于一些翻譯效率高的轉(zhuǎn)錄本是如何比其他轉(zhuǎn)錄本在其尾部結(jié)合更多的PABPC，目前還不清楚.對PABPC作用機制的研究表明，它的四個RNA結(jié)合域的作用不完全相同，并提示PABPC在poly(A)尾上的排列可能會為了響應(yīng)脫腺苷酸化而改變[37].目前尚不清楚PABPC在poly(A)尾上排列的變化是否影響翻譯或降解，進一步研究PABPC在基因表達中的多重作用將為這一領(lǐng)域提供答案.

5 結(jié)語

考慮到基因表達在生物學各個領(lǐng)域的重要性，poly(A)尾在基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中也不是一個被動的旁觀者，從mRNAs最初的生物發(fā)生到細胞質(zhì)中的動態(tài)控制，直至最終的降解，poly(A)尾的長度在mRNA穩(wěn)定性和翻譯等過程中扮演著重要的角色.隨著新技術(shù)的建立和快速的發(fā)展，可以更準確地對poly(A)尾的長度和異質(zhì)性進行讀取，對poly(A)尾的功能和作用機制的探索已經(jīng)逐漸成為基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控研究的一個熱點領(lǐng)域，將來會逐漸揭示在絕大多數(shù)真核生物mRNA上的這個附加成分poly(A)尾是如何被動態(tài)調(diào)控，進而對基因表達產(chǎn)生影響的.Poly(A)尾長度及異質(zhì)性的變化在許多生理和病理過程中的作用也將會逐漸被闡明.